[发明专利]用于分析AAV衣壳蛋白的方法

说明书

提供了用于使用液相色谱质谱和/或紫外(UV)‑可见光光谱来表征腺相关病毒(AAV)颗粒中的VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VPS衣壳蛋白的方法。所述方法总体上包含以下步骤：(a)使AAV颗粒经受液相色谱以变性并且然后分离所述VP1衣壳蛋白、所述VP2衣壳蛋白和所述VPS衣壳蛋白；以及(b)使在步骤(a)中产生的经分离的VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VPS衣壳蛋白经受UV和质谱以测定所述AAV颗粒中的所述VP1衣壳蛋白、所述VP2衣壳蛋白和所述VPS衣壳蛋白的比率和质量。另一方面，本公开提供了一种AAV组合物，其包括翻译后修饰。本公开还提供了用于使用液相色谱质谱表征AAV组合物的纯度的方法。

相关申请交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年1月03日提交的美国临时申请第62/956,681号、于2020年9月01日提交的美国临时申请第63/073,188号和于2020年12月01日提交的美国临时申请第63/119,909号的权益，所述美国临时申请中的每个临时申请的内容均以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本公开涉及用于使用液相色谱和质谱来表征腺相关病毒(AAV)颗粒中的VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白以及AAV组合物的纯度的方法。

背景技术

腺相关病毒(AAV)正迅速成为用于递送基因疗法的最广泛使用的媒剂之一。出色的安全特性以及广泛靶组织转导的高效率已经使AAV成为基因疗法的最广泛使用的平台。AAV是属于细小病毒科的小病毒。所述病毒由非包膜二十面体衣壳构成，所述非包膜二十面体衣壳含有约4.7个千碱基的线性单链DNA基因组。AAV通常在合适的宿主细胞中重组表达。然而，重组AAV可能被来自宿主细胞裂解物中的蛋白质所污染。

AAV衣壳包含VP1、VP2和VP3蛋白的混合物，所述蛋白质由单病毒Cap基因通过交替剪接和翻译产生，并且自组装以形成衣壳。AAV衣壳蛋白在病毒感染性、组织嗜性和效力方面发挥着重要作用，并且完全表征衣壳蛋白的质量和比率的能力对于用于基因疗法的AAV的商业化制造越来越重要。

特别是，VP的化学计量对于病毒载体的感染性至关重要。例如，高水平的VP3衣壳与不良的转导效率和降低的效力负相关，即使在VP1/VP2比率不平衡的情况下也是如此。(《基因疗法(Gene Therapy)》第25卷,第415-424页(2018))。由于结构蛋白VP1、VP2和VP3的比率从制造开始可能大范围内波动，例如1:1:5到1:1:20(《生物技术进展(BiotechnolAdv.)》,26(1):73-88(2008))，因此在AAV载体质量控制中，准确测量三种衣壳蛋白之间的比率很重要。然而，目前的方法试图测量衣壳蛋白的质量，但未能测定VP中的每种VP的化学计量(WO 2018/035059)。因此，基因疗法行业需要鲁棒的用于更准确地表征AAV衣壳蛋白的比率和修饰以及rAAV组合物的纯度的方法。

发明内容

本公开提供了使用液相色谱和质谱来表征腺相关病毒(AAV)颗粒中的VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白的方法。本文公开的方法用于测定AAV颗粒中VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白的比率和/或所述VP1衣壳蛋白、所述VP2衣壳蛋白和所述VP3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。

在一些方面，本公开提供了一种用于测定腺相关病毒(AAV)颗粒中VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白的比率的方法。所述方法包含以下步骤：在约70℃到约90℃下使所述AAV颗粒经受液相色谱，其中通过质谱和/或紫外(UV)-可见光光谱测定VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白的质量和比率。在一些方面，通过质谱测定所述衣壳蛋白的单独质量。在一些方面，所述AAV颗粒上的衣壳在所述液相色谱的柱上变性为单独的VP1、VP2和VP3蛋白。在一些方面，通过所述液相色谱来分离所述衣壳蛋白。

在一些方面，所述方法进一步包含使用质谱测定所述AAV颗粒中所述VP1衣壳蛋白、所述VP2衣壳蛋白和所述VP3衣壳蛋白中的一种或多种的质量。