[发明专利]通过肽-寡核苷酸复合物的纳米孔易位进行蛋白质和肽指纹识别和测序

说明书

一种用于使肽(11)易位穿过纳米孔(50)的方法(100)，其中方法(100)包括在寡核苷酸易位酶(20)的存在下使肽(11)易位，其中肽(11)由肽‑寡核苷酸复合物(10)包含，其中肽(11)连接至寡核苷酸(13)，其中寡核苷酸易位酶(20)在至少部分易位期间与寡核苷酸(13)相关联。

技术领域

本发明涉及一种用于使肽易位穿过纳米孔(translocating a peptide througha nanopore，通过纳米孔使肽易位)的方法。本发明还涉及一种分析肽的分析方法。本发明进一步涉及寡核苷酸易位酶(translocase，移位酶)用于使肽-寡核苷酸复合物易位的用途。本发明进一步涉及纳米孔用于表征肽-寡核苷酸复合物的用途。本发明进一步涉及纳米孔用于对蛋白质进行指纹识别或测序的用途。本发明进一步涉及纳米孔用于表征蛋白质上的翻译后修饰的用途。本发明进一步涉及一种多组分试剂盒(kit of parts，多组件试剂盒)。

背景技术

用于使肽易位穿过纳米孔的方法是本领域已知的。例如，WO2013123379A2描述了一种使蛋白质易位穿过纳米孔并监测由蛋白质中不同氨基酸引起的电子变化的装置和方法。该装置包括膜中的纳米孔、用于在膜的顺式侧和反式侧之间提供电压的放大器、以及加工待易位的蛋白质的NTP驱动的解折叠酶。示例的解折叠酶是来自大肠杆菌的ClpX解折叠酶。

US20170199149描述了一种基于纳米孔的蛋白质分析方法。该方法解决了目标蛋白质分析物的表征，该蛋白质分析物的尺寸大于纳米孔隧道的内径，并且还与聚合物物理关联。该方法进一步包括向纳米孔系统施加电势以使聚合物与纳米孔隧道相互作用。测量通过纳米孔的离子电流以提供反映与纳米孔隧道相互作用的聚合物部分的结构的电流模式。这被用作表征不穿过纳米孔的相关蛋白质的度量。

Nivala,et al.,“Unfoldase-mediated protein translocation through anα-hemolysin nanopore”,Nature Biotechnology,2013描述了使用AAA+解折叠酶CIpX使蛋白质解折叠和易位穿过a-溶血素孔。其进一步描述了在易位过程中检测到个体工程蛋白的序列依赖性特征。

WO2012107778描述了Msp孔蛋白的突变形式。其进一步描述了使用Msp的核酸表征。具体而言，其描述了一种表征靶核酸序列的方法，包括：(a)使靶序列与Msp-衍生的孔和核酸结合蛋白接触，以使所述蛋白质控制靶序列通过所述孔的运动，并且靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用；和(b)测量每次相互作用期间通过孔的电流，从而表征靶序列。

WO2017125565描述了一种在膜中制备纳米孔测序复合物的方法，其用于对聚合物(例如多核苷酸和多肽)进行测序。纳米孔测序复合物是通过酶与插入膜中的纳米孔以及聚合物与酶的顺序连接而形成的。可替代地，通过将预先形成的酶-聚合物复合物与插入膜中的纳米孔连接来形成纳米孔测序复合物。

Derrington,et al.,“Subangstrom single-molecule measurements of motorproteins using a nanopore”,Nature Biotechnology,2015描述了一种在核酸穿过纳米孔时监测DNA运动和进行性核酸结合蛋白构象变化的方法。

发明内容

生物学的中心法则可能认为DNA编码了产生蛋白质所需的信息，蛋白质执行我们与生物体相关的许多功能。蛋白质催化反应、运输化学物质、发送和携带信号、创建结构等。为了产生蛋白质，基因可以从DNA转录到信使RNA上，然后RNA可以翻译成氨基酸链以提供蛋白质。尽管蛋白质在生物体中发挥着重要作用，但蛋白质的检测和表征可能仍然是一个昂贵且耗时的过程。