[发明专利]产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法

权利要求书

1.一种产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是胞内共表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌、或者是分别胞内表达α-葡聚糖磷酸化酶基因、葡萄糖磷酸变位酶基因、葡萄糖磷酸异构酶基因、6-磷酸塔格糖差向异构酶基因和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌的混合物；

所述枯草芽孢杆菌的出发菌株为敲除了蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌菌株。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中包括共表达α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶的胞内表达载体，或者为包含α-葡聚糖磷酸化酶的胞内表达载体的基因工程菌、包含葡萄糖磷酸变位酶的胞内表达载体的基因工程菌、包含葡萄糖磷酸异构酶的胞内表达载体的基因工程菌、包含6-磷酸塔格糖差向异构酶的胞内表达载体的基因工程菌和包含6-磷酸塔格糖磷酸酶的胞内表达载体的基因工程菌的混合物。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶分别为耐热α-葡聚糖磷酸化酶、耐热葡萄糖磷酸变位酶、耐热葡萄糖磷酸异构酶、耐热6-磷酸塔格糖差向异构酶和耐热6-磷酸塔格糖磷酸酶。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述耐热是指在40℃以上具有酶的活性。

5.如权利要求1至4任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中内源性的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因，α-淀粉酶基因，孢子形成RNA 聚合酶 σ^F因子基因，和表面活性肽合成酶亚基3基因均被失活或敲除。

6.一种用于枯草芽孢杆菌的胞内表达载体，其特征在于，其包含α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸塔格糖差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸酶基因，并能够实现这些基因的胞内共表达；其中所述枯草芽孢杆菌为敲除了蛋白酶基因的枯草芽孢杆菌菌株。

7.利用如权利要求1至5任一项所述的基因工程菌的全细胞催化淀粉制备生产塔格糖的方法，其包括下述步骤：

(1) 将所述枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵获得全细胞；

(2) 将步骤（1）获得的枯草芽孢杆菌全细胞进行细胞膜通透性处理，获得透性全细胞；

(3) 利用步骤（2）获得的透性全细胞催化淀粉制备塔格糖，其中对于共表达的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞直接用于催化，对于分别表达各种酶的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞，则进行混合用于催化。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括将步骤（2）中获得的枯草芽孢杆菌透性全细胞进行固定化处理，获得固定化全细胞，或者固定化全细胞混合物，然后再用于催化。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）的全细胞的制备是通过适于表达外源蛋白的发酵方法获得的。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的细胞膜通透性处理是通过热处理、添加有机溶剂和/或添加表面活性剂处理获得。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、乙腈；所述表面活性剂选自十六烷基三甲基溴化铵、Tween-80。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述热处理的温度为45-100℃，热处理时间为10-100 min；处理时细胞浓度为OD₆₀₀ = 10-300。