[发明专利]异源合成黄酮类化合物的宿主细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种异源合成黄芩素、野黄芩素类或白杨素类化合物的宿主细胞及其应用。本发明提供了新型的黄芩素、野黄芩素类化合物或白杨素类化合物生物合成的优化改造，可实现以原核生物为底盘利用酶自组装技术合成黄芩素、野黄芩素和白杨素类化合物，以及实现利用葡萄糖从头合成黄芩素类化合物。本发明也揭示了优化改造后的宿主细胞及其应用。

技术领域

本发明涉及合成生物学及医药技术领域，具体地，本发明涉及异源合成黄酮类化合物的宿主细胞及其应用。

背景技术

黄芩素和野黄芩素是黄酮类化合物，主要存在于中药黄芩中。这两种活性黄酮仅在黄芩等相关药用植物的根中积累较少。黄芩素和黄芩素都是通过类黄酮生物合成途径合成的。黄芩素和野黄芩素具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、护心等重要生理活性。最近，黄芩素在体外被报道为SARS-CoV-2 3Clpro的抑制剂，显示了中药的巨大潜力。

目前，黄酮类化合物的主要来源是从植物中提取和化学合成。然而，由于使用有毒化学物质和极端的反应条件，植物萃取或化学合成无法提供大规模生产的绿色路线。因此，微生物合成黄酮类化合物的研究已经深入开展。由于从植物引入复杂的异质途径，酶的失衡和中间代谢物的积累，通常会导致产物滴度低。为了解决这些问题，采用多变量模块化方法，通过调节启动子强度和质粒拷贝数来合成黄酮类化合物。然而，它是费时的，总是需要大量的工作。之前的工作报道了在工程酵母和大肠杆菌中实现黄芩素和野黄芩素的合成，但黄芩素和野黄芩素的产量仍处于很低水平。

建立底物通道是提高酶在体内催化效率的有效途径。利用相互作用蛋白对组装多酶已被证明是提高催化效率的有效方法。脚手架也是增加产品滴度的有效策略，许多不同构象的连接子被开发用于构建各种相互作用蛋白。

在本领域中，多种天然产物的合成元件经过组装后实现了在微生物中的异源合成。但是利用生物体内酶组装策略生产黄芩素和野黄芩素这两种活性黄酮类化合物还尚未见报道；从葡萄糖合成黄芩素和野黄芩素的大肠杆菌还尚未见报道。

因此，本领域亟待优化能够高效地异源合成黄芩素和野黄芩素或类似化合物的微生物菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供异源合成黄芩素、野黄芩素类或白杨素类化合物的宿主细胞及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于合成黄芩素、野黄芩素类化合物(如黄芩素或野黄芩素)的原核细胞，其包括外源的下组酶的编码基因：黄酮6-羟化酶(F6H)，细胞色素P450氧化还原酶(CPR)，苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)和黄酮合成酶I(FNSI)；且所述酶被表达后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)构成复合体(复合反应器)。

在本发明的另一方面，提供一种用于合成白杨素类化合物(如白杨素或芹菜素)的原核细胞，其包括外源的下组酶的编码基因：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)和黄酮合成酶I(FNSI)；且所述酶被表达后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)构成复合体(复合反应器)。

在一个优选例中，所述的苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酸辅酶A连接酶的复合体包括：苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酸辅酶A通过蛋白-蛋白相互作用结构域及其配体的结合而靠近，获得复合体。

在另一优选例中，所述的苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酸辅酶A连接酶直接连接或通过连接子连接、获得融合蛋白形式的复合体。

在另一优选例中，所述蛋白-蛋白相互作用结构域包括选自下组的结构域：PDZ结构域，SH3结构域，WW结构域，LIM结构域，DD结构域，PH结构域，EH结构域，GBD结构域。