[发明专利]用于单细胞检测和分析的方法及其应用

说明书

本发明涉及单细胞检测分析领域，公开了一种用于单细胞检测和分析的方法。该方法通过利用数字PCR仪实现一步法对样品进行单细胞分离、细胞裂解以及对其中的目标序列进行检测和分析，实现了数字PCR仪应用范围的扩大，使其能够用于微量细胞的检测，同时能够精准定量样品中每个单细胞内的目标基因，还能够实现对目标基因的表达水平的检测，并且还可以用于验证单细胞测序的结果。

技术领域

本发明涉及单细胞检测分析领域，具体涉及一种用于单细胞检测和分析的方法及其应用。

背景技术

单细胞分析技术是一种具有高灵敏度、高选择性、高时空分辨等特点的新型细胞研究技术，目前常见的单细胞分析技术有单细胞分离、单细胞测序等。单细胞分析技术由于灵敏度和准确度高，非常适用于生物学和医学检测。

数字PCR(dPCR)技术是一种基于微流控的核酸分子绝对定量技术，该技术通过将样品微滴化，将其中的目标核酸分子分配到微液滴中，每个微液滴中分配到的目标核酸分子数量为0-1个，并将每个微液滴作为一个反应单元进行PCR反应，对其中的核酸分子进行扩增，通过计算机软件对阳性微液滴的数量进行统计从而实现对样品中核酸分子的绝对定量。

dPCR与传统荧光定量PCR(qPCR)相比，所需样品量更少，并且dPCR是一种绝对定量的方法，其与qPCR相比对于Ct值的依赖性很小，尤其适用于样品中含量极少的稀有细胞检测分析，例如，肿瘤患者血液样品中循环肿瘤细胞(CTC)的检测、干细胞发育、早期胚胎发育、体外受精植入前筛查、肿瘤穿刺或激光微切割组织、新型稀少免疫亚群细胞等。但是dPCR一般用于检测已经分离出的核酸分子，其仍无法区分来自不同细胞中的核酸，也无法对单个细胞进行定性或定量检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的qPCR依赖于Ct值，且需求样品量较大，无法满足稀有细胞检测需要，而dPCR虽然对样品的需求量小，但是无法实现对单个细胞进行检测的问题，提供一种用于单细胞检测和分析的方法，该方法具有需要的样品量少、检测灵敏度高、准确度高，并且能够对单细胞个数进行准确定量，同时在单细胞水平对稀有细胞中的靶蛋白表达水平进行检测等优点。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种用于单细胞检测和分析的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将含细胞的样品、细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂引入数字PCR仪，在数字PCR仪的微滴生成仪中，含有细胞裂解剂、添加剂和PCR试剂的细胞分离体系被包裹在微滴中，每个微滴中含有0-1个单细胞；然后在使细胞发生裂解的条件下进行裂解并对裂解产物中的目标序列进行扩增；再基于扩增结果进行统计分析；

其中，细胞分离体系中添加剂的浓度为0.5-25重量％。

本发明第二方面提供如上所述的方法在检测循环肿瘤细胞、验证单细胞测序结果、检测靶蛋白在细胞中的表达、检测单细胞中的基因突变中的应用。

通过上述技术方案，本发明提供的方法实现了样品(尤其是细胞含量少的样品)中单细胞的分离和检测，且该方法细胞包裹效率高、检测准确性高，不仅能够实现样品中单细胞基因分析(例如单细胞测序、基因突变检测等)，并且能够对样品细胞中的靶蛋白在表达水平进行检测(例如靶蛋白表达量分析、标志物检测等)，而且其高精准度的特点还使得本发明提供的方法能够应用于单细胞测序结果的验证，排除假阴性和假阳性结果，对测序结果进行初步筛选。

附图说明

图1是实施例1中采用荧光显微镜对HepG2-GFP细胞的单细胞分离情况观察结果；

图2是实施例1中HepG2-GFP单细胞经扩增16s rRNA基因后的分析结果；

图3是实施例1中H1975细胞系经单细胞分离后检测EGFR T790M突变的结果；

图4是实施例1中A549细胞系经单细胞分离后检测EGFR WT的结果；