[发明专利]非洲猪瘟病毒I177L基因重组质粒、表达载体及制备方法

说明书

本发明提供了非洲猪瘟病毒I177L基因重组质粒、表达载体及制备方法。所述制备方法，包括步骤：向I177L基因两端添加NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点后，连入经NotⅠ和EcoRⅠ双酶切的pMAL‑c5X载体中，得到重组质粒pMAL‑I177L。所述重组质粒pMAL‑I177L可用于制备I177L蛋白的表达载体。该质粒含有一段特异性蛋白酶识别位点序列，融合蛋白纯化后，通过蛋白酶可将目的蛋白与MBP切割分离，可得到高浓度可溶性的I177L蛋白，为进一步探究I177L蛋白的生物学功能、制备多克隆抗体、建立基因缺失毒株鉴别诊断方法以及疫苗研制提供参考。

技术领域

本公开属于微生物检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒I177L基因重组质粒、表达载体及制备方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种线性双股DNA病毒，该病毒的粒子结构与虹彩病毒相似，大小相似，但是该病毒的基因结构以及复制方式则与虹彩病毒不同，而是有着与痘病毒相同的特点。在病毒分类上，国际病毒分类委员会先后在第四次和第五次报告中将其归类于虹彩病毒科和痘病毒科。随着分子生物学技术的发展，对非洲猪瘟病毒DNA序列分析表明，非洲猪瘟病毒虽然具有痘病毒和虹彩病毒的部分特征，但不属于国际病毒分类委员会之前所核定的任何一科，是一个全新的病毒科，因此，目前该病毒归属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivims)，而且是其中的唯一成员，也是虫媒病毒中唯一的DNA病毒。

ASFV基因组长170-194kb，含有150-167个开放阅读框((Open reading frames，ORF)，编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白，绝大多数蛋白质的功能及作用机制尚不明确。基因组包含中间约130kb比较稳定的基因区(stable region)，两边是约20～40kb的由串联重复序列和多基因家族(mμLtigene families，MGF)构成的可变区(variableregion)，末端是有37nt部分碱基互补配对的发卡环结构(hairpin loop)。ASFV病毒粒子由里到外主要由5部分组成：含病毒基因组DNA的拟核、内核芯壳(core shell)、内膜(innerenvelope)、衣壳(capsid)和囊膜(external envelope)。行使各种各样的功能，包括病毒形态的维持、病毒吸附与入侵宿主细胞、病毒的复制、病毒对宿主细胞代谢的调控、免疫逃避等。例如，p30蛋白由CP204L基因编码，分子质量大小为30ku，在ASFV感染早期表达。p30参与病毒入侵细胞的过程。感染早期，ASFV通过多种通路干扰宿主细胞的蛋白质正常合成，以促进病毒自身的复制，早期蛋白p30可能起到相应的作用。p54是跨膜蛋白,也是重要的结构蛋白之一，由E183L基因编码，分子质量大小为25ku。同p30蛋白一样，p54蛋白也参与病毒入侵宿主细胞的过程。p54蛋白在宿主细胞内质网的聚集并转化为病毒囊膜的过程中起到关键作用；除此之外能够诱导受感染细胞产生细胞凋亡，被认为是主要的毒力蛋白之一；同时也介导ASFV在细胞内的转运。p72蛋白是ASFV的主要结构蛋白之一，由B646L基因编码，分子质量大小为73.2ku，约占病毒蛋白总量的30％左右，是病毒正20面体衣壳结构的主要组成成分。p72蛋白在宿主细胞内合成后分布于细胞质和内质网的囊泡中，随后在内质网上形成核衣壳或核衣壳前体物质。p72蛋白在形成正20面体结构时需要其他蛋白的辅助，比如p49蛋白、pB602L蛋白和CAP蛋白(capsid-associated protein)，此类蛋白被称作辅助蛋白，辅助蛋白缺失会导致核衣壳正20面体的结构和成分出现异常。

迄今，国际上采用基因工程手段获得了多个ASFV基因缺失疫苗候选株，以及通过细胞传代致弱和从自然界分离弱毒株的方法获得了弱毒疫苗候选株，其中一些疫苗候选株在研究报道中针对同源病毒株攻击有50％～100％保护率，但对异源病毒的攻击保护效果不甚理想。此外，无论是人工基因缺失弱毒株还是自然缺失弱毒株，猪免疫后出现剂量依赖性副反应，免疫猪出现精神沉郁、食欲降低、发热、病毒血症、高丙球蛋白血症、肺炎、关节肿胀、跛行、慢性病变和僵猪等症状，降低了疫苗的实际使用价值。