[发明专利]共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒及应用

权利要求书

1.一种共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒，其特征在于，包括如下步骤：

(1)杆状病毒表达载体的构建

扩增rPoIFN-L3和rPoIL-22基因全长，得到PCR产物；将所得PCR产物进行切胶纯化，先用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切pFastBacdual载体，将切胶纯化的rPoIFN-L3用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切，将酶切产物进行PCR纯化；将酶切过的pFastBacdual与rPoIFN-L3使用T4连接酶进行连接；将测序正确的pFastBacdual-rPoIFN-L3质粒用Xho Ⅰ、Sph Ⅰ进行双酶切，通过切胶纯化得到的rPoIL-22用Xho Ⅰ、Sph Ⅰ进行双酶切；然后进行质粒的提取，得到pFastBacdual-rPoIFN-L3-rPoIL-22质粒；

(2)重组杆状病毒的构建

将pFastBacdual-rPoIFN-L3-rPoIL-22转化感受态DH10Bac后，经3次蓝白斑筛选，然后进行杆粒的提取；

(3)rPoIFN-L3和rPoIL-22的表达

首先转染昆虫细胞，以含10％胎牛血清的Grace’s培养液培养SF21细胞；准备杆粒DNA、Cellfectin试剂混合在灭菌管中，离心除去细胞和大的碎片；使用滤器过滤上清后，将上清转到新的离心管中避光保存得到P1代毒株；将P1代毒接种到细胞中，收取上清，获得P2代病毒；将P2代病毒接种昆虫细胞，获得P3代病毒；将P3代病毒接种到细胞中，收取上清，离心去掉细胞和大的碎片，使用滤器过滤上清后，将上清转到新的离心管中，获得含有rPoIFN-L3和rPoIL-22的上清。

2.根据权利要求1所述的一种共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒，其特征在于，

所述步骤(1)中，将所得PCR产物进行切胶纯化，具体步骤如下：

1)用干净的手术刀切割含DNA片段的凝胶片，将凝胶放入预先称重的EP管中并进行称重，记录凝胶重量；

2)加入1体积的Binding Buffer到凝胶切片中；

3)将凝胶混合物在58℃孵育10min左右，直到凝胶片完全溶解，期间每隔2min倒置混合管以促进融化；

4)将溶解的凝胶溶液转移到Gene JET纯化柱中，12000r/min离心1min，弃掉收集管中的液体，将纯化柱再放回收集管中；

5)将Wash Buffer加入纯化柱，12000r/min离心1min，弃掉收集管中的液体，将纯化柱再放回收集管中；

6)将空的Gene JET纯化柱12000r/min离心1min；

7)将纯化柱转移到新的EP管中，加65℃灭菌水到柱中，静置1min，12000r/min离心1min，用紫外分光光度计测浓度后保存到-20℃。

3.根据权利要求1所述的一种共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒，其特征在于，

所述步骤(1)中，将酶切产物进行PCR纯化步骤如下：

1)将酶切产物移至干净的EP管中；

2)加3倍体积的Binding Solution到酶切产物中，振荡混合均匀；

3)将Spin Column放入收集管中，将2)中混合液转移至Spin Column中，以12000r/min离心1min，丢弃收集管中的液体，将Spin Column再放回收集管中；

4)加Wash Solution至柱子中，静置1min，12000r/min离心1min，丢弃收集管中的液体，将Spin Column再放回收集管中；重复此步骤一次；

5)以12000r/min离心5min，将Spin Column转移到新的EP管中，加65℃灭菌水到SpinColumn，静置1min，12000r/min离心1min；用紫外分光光度计测浓度后保存到-20℃。