[发明专利]共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒及应用

说明书

本发明公开了应用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒。通过间接免疫荧光、Western‑blot证明共表达的rPoIFN‑L3和rPoIL‑22能够分泌表达于细胞上清中。共表达的rPoIFN‑L3和rPoIL‑22具有良好的生物学活性，且分别能有效地在体外抑制TGEV/PEDV/PDCoV的感染。另外，研究发现50ng/mL浓度时rPoIFN‑L3和rPoIL‑22在体外具有协同抗TGEV/PEDV作用。通过该蛋白表达系统可以获得大量具有生物学活性的rPoIFN‑L3和rPoIL‑22，本发明的提出为进一步实现产业化抗猪肠道冠状病毒感染的制剂奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及应用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒和应用。

背景技术

由肠道病毒引起的腹泻病在养猪业中非常普遍并且具有重要的经济意义，其中冠状病毒最为主要，它由α、β、γ和δ这4个属组成。已发现的几种猪肠道冠状病毒中，传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和2017年新出现的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)属于α冠状病毒，猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)属于δ冠状病毒。在2012～2018年对南方地区进行的猪腹泻相关病毒的调查结果显示，PEDV是最常检测到的病毒，其样本中的患病率为50.21％～62.10％，其次为PDCoV。几种猪肠道冠状病毒除了单独感染外，混合感染也非常常见。而几种猪肠道冠状病毒它们的抗原不同，无法提供交叉保护。需要针对单一病毒的疫苗或治疗剂，但到目前为止还没有关于PDCoV和SADS-CoV疫苗的报道，这使得如何有效抑制几种猪肠道冠状病毒感染成为亟需解决的问题。

研究发现几种猪肠道冠状病毒它们细胞受体虽然不同，但它们都主要作用于肠道上皮细胞。IL-10家族细胞因子IFN-L和IL-22选择性作用于黏膜上皮细胞，如呼吸道、肠道等。其在黏膜上皮屏障抗感染过程中发挥着重要作用。我们实验室前期研究证实原核表达的IL-22和IFN-L能够显著抑制猪肠道冠状病毒感染，而且IFN-L3在抗猪肠道冠状病毒方面优于IFN-L1和Ⅰ型干扰素(IFN-α)。另外有研究指出IFN-L和IL-22可以协同抑制轮状病毒的感染，鉴于猪肠道冠状病毒与轮状病毒都主要作用于肠道上皮细胞，我们推测IFN-L3和IL-22可协同抑制猪肠道冠状病毒感染。

杆状病毒/昆虫细胞表达系统在实际应用过程中具有产物表达水平高，表达产物可进行翻译后加工，外源蛋白的免疫源性、抗原性和功能等生物活性与天然蛋白质相似，大规模生产基因工程产品成本低等优点，是基因工程四大表达系统之一。至今还没有应用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共表达猪干扰素L3和猪白介素22的报道。

发明内容

鉴于以上情形，为了解决上述技术存在的问题，本发明提出应用杆状病毒/昆虫细胞表达系统共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒，通过间接免疫荧光、Western-blot证明共表达的rPoIFN-L3和rPoIL-22能够分泌表达于细胞上清中。共表达的rPoIFN-L3和rPoIL-22具有良好的生物学活性，且分别能有效地在体外抑制TGEV/PEDV/PDCoV的感染。另外，研究发现50ng/mL浓度时rPoIFN-L3和rPoIL-22在体外具有协同抗TGEV/PEDV作用。通过该蛋白表达系统可以获得大量具有生物学活性的rPoIFN-L3和rPoIL-22，为进一步实现产业化抗猪肠道冠状病毒感染的制剂奠定基础。

共表达猪干扰素L3和猪白介素22重组杆状病毒，包括如下步骤：

(1)杆状病毒表达载体的构建