[发明专利]一种α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种新型α‑L‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，属于基因工程和生物催化领域。具体涉及一种新型的α‑L‑鼠李糖苷酶及其氨基酸序列、编码上述氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重组载体和重组细胞、利用上述重组细胞制备α‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及上述α‑L‑鼠李糖苷酶在阿可拉定生产中的应用。本发明所提供的α‑L‑鼠李糖苷酶可以高效逐步水解断裂朝藿定C外侧和内侧鼠李糖苷键。在α‑L‑鼠李糖苷酶和β‑D‑葡萄糖苷酶的共同催化下，底物朝藿定C几乎全部转化为阿可拉定，转化率高达99%以上、无副产物、步骤简单、反应时间短、且污染小。

技术领域

本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。

背景技术

淫羊藿是一种中国传统中药，具有补肾祛湿等功效。淫羊藿药材中的主要活性成分有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等黄酮皂苷，其中朝藿定C（图1）含量最高，占黄酮总量的70%左右。

阿克拉定（图1），又名淫羊藿素，具有抗炎、调节免疫等作用，是朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等苷元。研究显示，阿克拉定还具有显著的抗癌活性，尤其是对肝癌细胞具有较好的抑制作用。目前该天然抗肿瘤药物已经进入三期临床实验，未来阿可拉定有望成为晚期肝癌临床治疗的一个重要选择，在药物领域具有广阔的应用前景。

阿可拉定在天然植物中主要是以皂苷形式存在，游离的含量极少，因此从植物中直接提取制备阿可拉定效率低且浪费资源（中国专利申请号：201710079813.8）。而利用水解去除黄酮皂苷的糖基得到阿可拉定成为了目前的主要制备途径。传统的水解方法为酸解法和Smith降解法，虽然皂苷上的糖基可以被有效水解断裂得到阿可拉定，但是该过程对环境污染大、步骤较为复杂，不符合绿色制造战略要求（中国专利申请号：201711485889.7和201810250390.6）。因此生物法转化制备阿可拉定成为了目前该领域的主要研究热点。

中国专利（中国专利申请号：201510128987.X）公开了使用葡萄糖苷酶转化淫羊藿提取物制备阿可拉定，但是收率只有20%。中国专利（中国专利申请号：201310674836.5）还公开了使用果胶酶转化淫羊藿提取物制备阿可拉定，但是收率也只有20%；最近有（中国专利申请号：201910220551.1、201710565481.4）采用化学合成法制备阿可拉定的报道，但是合成法涉及到的催化剂昂贵，且副产物多，不易分离纯化。

朝藿定C在植物中含量丰富，以朝藿定C为底物制备阿可拉定是一种很有潜力的制备途径。朝藿定C的C₇位置有一个葡萄糖基，在C₃位置连有两个鼠李糖基，因此从朝藿定C转化制备阿可拉定主要涉及到葡萄糖苷键的断裂和鼠李糖苷键的断裂。已有相关专利公开了一些鼠李糖苷酶水解断裂朝藿定C上的外侧鼠李糖苷键制备淫羊藿苷（中国专利申请号：201810110773.3，201811307005.3），但是这些酶无法做到同时水解外侧和内侧的鼠李糖苷键，制约了阿可拉定的规模制备和广泛应用。因此挖掘一种能同时高效水解朝藿定C外侧和内侧的鼠李糖苷键的酶对于阿可拉定的规模生产至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新型α-L-鼠李糖苷酶及其基因、编码所述糖苷酶氨基酸序列的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞、以及所述α-L-鼠李糖苷酶在制备阿可拉定生产中的应用。所述α-L-鼠李糖苷酶可以高效催化水解朝藿定C外侧和内侧的鼠李糖苷键，弥补该领域的空白，促进阿可拉定的酶催化工业生产。

为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：