[发明专利]烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺

权利要求书

1.烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID NO：2)，并克隆至载体pMD-18T，形成携带NrK1编码基因的重组载体pMD-18T/NrK1，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，通过Genebank查阅酿酒酵母絮凝素锚定蛋白f1ol编码DNA序列，全合成该基因并克隆至载体pMD-18T，形成携带flol编码基因的重组载体pMD-18T/flol，该载体转化大肠杆菌Top10，进行质粒的扩增和保存，并且设计引物Pl、P2、P3、P4，其中P1、P2以载体pMD-18T/flol为模板扩增flol的编码基因，在Pl上带有Not I的酶切位点，P2上则带有连接肽GGGGS五个氨基酸的编码序列，P3、P4以pMD-18T/NrK1扩增NrK1编码基因，P2和P3有18bp的重叠区，P4上带有组氨酸标签His-Tag的编码序列和Xba I酶切位点，通过PCR扩增，可分别获得flol的编码DNA片段和NrK1编码DNA片段，由于P2和P3有18bp的重叠区，采用重叠PCR的方法可以将两个片段组装成一个基因片段，用Not I/Xba I双酶切将基因片段和载体pHBM368-pgk，DNA连接反应将flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA片段定向插入到该载体启动子pgk控制下的开放阅读框(ORF)中，构建成酿酒酵母NrK1重组展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk；

S2、酿酒酵母工程细胞酶的制备：将酿酒酵母絮凝素锚定蛋白flo1和烟酰胺核苷激酶(NRK)串联形成融合蛋白，合成该融合蛋白的编码基因，将该基因定向插入S1中酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(ORF)中，经载体的线性化和电转化，将目的基因导入酿酒酵母INVSc，目的蛋白表达后并向酵母细胞外分泌，通过凝素锚定蛋白flo1成功展示于酿酒酵母细胞壁表面，形成具有催化功能的全酿酒酵母工程细胞酶；

S3、全细胞催化剂制备：以S1中备用的NrK1突变体中氨基酸序列(SEQ ID N0：1)为基础按照酿酒酵母偏爱密码子设计成为NrK1的编码DNA序列，将此DNA序列通过一段柔性连接肽(GGGGS)的编码DNA序列连接在酿酒酵母絮凝素flol锚定蛋白编码DNA的下游，形成flo1-NrK1的完整编码DNA序列，并在该基因下游添加组氨酸标签(His-Tag)编码序列，采取全基因合成的方式合成flo1-NrK1-His-Tag的编码DNA，将目的编码DNA定向插入酿酒酵母展示表达载体pHBM368-pgk中以pgk为启动子的开放阅读框(0RF)中，经载体的线性化和电转化，使目的基因导入酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，以Sc平板对重组转化子进行初筛，3-4天后可得到酿酒酵母的阳性转化子，转化子再经YPD平板活化，接种YPD液体培养基扩大培养，收集酵母细胞，用FITC标记的抗His-Tag抗体进行免疫荧光染色，通过荧光倒置显微镜观察细胞的荧光强度，进一步筛选出高效表面展示NrK1的重组酵母细胞，对高效表面展示NrK1的重组酵母细胞进行高密度发酵，收集发酵细胞，真空冷冻干燥，制备成全细胞催化剂；

S4、酵母转化和重组子的筛选：将S2中制得的展示表达载体NrK1/pHBM-368-pgk用HpaI酶切线性化，电转化酿酒酵母INVSc(His-、Leu-、Trp-、Ura-)，转化后的酵母细胞铺于Sc平板，培养3-4天，因INVSc为营养缺陷型，在不含Ura的培养基上不能生长，但载体NrK1/pHBM-368-pgk带有Ura的合成基因，因而只有导入并稳定整合重组载体的酵母细胞才能在Sc培养基上生长，挑选Sc生长的单个菌落，用Sc液体培养基(0.67％YNB、2％葡萄糖、0.01％氨基酸(His，Trp，Leu))扩大培养，离心收集细胞，做进一步的鉴定和筛选；

S5、高效表面展示NrK1的酿酒酵母的筛选：将S1中制备的NrK1的羧基端带有组氨酸标签His-Tag，可采用免疫荧光方法进一步筛选高效表面展示NrK1的酿酒酵母细胞，收集上述扩大培养的酿酒酵母细胞，取106个细胞，重悬于200mL Buffer A，并搅拌混匀离心后，弃上清，再200mL Buffer B洗涤一次，离心后去上清，将细胞重悬于50μL含FITC标记抗His-Tag单抗(1∶1000稀释)的Buffer B中避光静置，然后转至室温内避光静置1h，再进行离心处理，弃上清后，1×PBS洗2次，重悬细胞于200μl1×PBS中，并且通过使用荧光倒置显微镜观察细胞荧光和流式细胞术挑选荧光强度最大的酿酒酵母菌株作为全酵母工程细胞酶备用；

S6、全酵母工程细胞酶的活力检测：将S6中筛选高效展示NrK1酶的酵母工程细胞接种200mL的YPD液体培养基，进行摇瓶发酵培养，收集细胞，1×PBS洗细胞3次，真空冷冻干燥保存，作为全酵母工程细胞酶，该酶可在Mg2+和ATP存在条件下，一步转化烟酰胺核苷(NR)为烟酰胺单核苷酸(NMN)，反应体系为：1×PBS(pH 7.4)、50mM ATP、10mM MgCl2、50mM烟酰胺核苷(NR)、20mg/ml全酵母工程细胞酶，于20、30、40、50、60℃，20rpm/min摇动反应4h，4000rpm/min离心5min，取上清进行HPLC分析，通过标准品对照，对生成的NMN进行定量和定性分析，按照国际酶单位(IU)定义，即1min催化形成1μmol NMN的酶量为一个国际单位(IU)，计算全酵母工程细胞酶的比活力，根据反应体系中NMN的生产量计算转化率；

S7、全酵母工程细胞酶的再使用：待S6中反应结束后，将整个反应体系置于离心管进行离心处理，收集酵母工程细胞，重新配制上述反应体系，将收获的酵母工程细胞加入体系中，于40℃、20rpm/min摇动反应4h，收集上清，HPLC检测NMN的生产量，计算酶的活力和转换率，按此方法再重复使用酶4次，分别计算出该酶每次重复使用时的活力和转化率。