[发明专利]烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺

说明书

本发明提供烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，涉及酶工程技术领域。该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，包括以下步骤：S1、酿酒酵母的烟酰胺核苷激酶重组展示表达载体的构建：根据NrK1突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)设计NrK1的编码DNA序列，密码子采用酿酒酵母的偏爱密码子，以全基因合成的方式合成NrK1的编码DNA(SEQ ID NO：2)。该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，该烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，可将不同生物来源可催化NMN合成的高活性酶通过基因工程技术锚定表达于酿酒酵母的细胞壁表面，形成具有高效合成NMN的全酵母工程细胞酶。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别的为烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺。

背景技术

NMN(烟酰胺单核苷酸)在人体细胞能量代谢中扮演着重要角色，它参与细胞内最重要的电子转移载体NAD+(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的合成，也是细胞NAD+补救合成的中间体，在哺乳动物体内，NMN由NMN由烟酰胺(Nicotinamide，Nam)在Nampt的催化下生成，随后NMN在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(Nicotinamide mononucleotideadenosinetransferase，Nmnat)的催化下生成NAD+，细胞外NMN需要去磷酸化为NR(烟酰胺核苷)才能进入肝细胞，在烟酰胺核苷激酶的作用下磷酸化重新生成NMN，随后NMN在Nmnat的作用下与ATP反应生成NAD+，NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等，

但是现有技术中，传统的NMN生产是一种化学合成的方式，即以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，生产率较低，产品纯度低，含有约50％的手性分子α-NMN，且有毒，难分离，故收率非常低，另外，在合成过程中需要使用大量的有机溶剂，对环境破坏严重，近年来，生物催化技术已用于NMN的生产，通过重组DNA技术生产的烟酰胺核苷激酶(NRK)可在体外高效转化烟酰胺糖苷(NR)生产NMN，这是一种绿色生物转换，对环境污染几乎为零，不产生手性分子α-NMN，产率高，成本低，是NMN生产技术的一次重大革命，但NRK几乎都是来自大肠杆菌表达的游离酶，需要对酶进行分离纯化，无法多次重复使用，而且大肠杆菌的脂多糖LPS一直是药品和保健食品生产上的一个安全威胁，使实际生产过程较为繁琐，资源重复利用率较低，使实际生产效果欠佳。

发明内容

本发明提供的发明目的在于提供一种烟酰胺核苷激酶全酵母细胞及其生物催化合成NMN工艺，能够安全、高效的进行实际生产使用，且可多次重复进行生产原料的使用，进而有效减少实际成本的投入。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：烟酰胺核苷激酶全酵母细胞生物催化合成NMN工艺，包括有以下步骤：