[发明专利]NK细胞类外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S101：分离：把NK细胞培养物转入500ml离心管，2000rpm离心20分钟；上清为NK细胞培养上清液，沉淀为NK细胞；

S102：收集：把NK细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中，2000Xg离心30分钟去除细胞碎片；把去除碎片后的NK细胞培养上清液(NKS)收集在新的容器中，1000ml，含有大量的NK细胞外泌体(NKE)；

S103：悬浮：用生理盐水悬浮S101沉淀中的NK细胞，离心洗涤一次，再悬浮在生理盐水中，调整NK细胞浓度为2*10⁷/ml，500ml；

S104：冻融：把S103的NK细胞悬浮液放液氮中快速冷冻，然后37℃水浴充分融解；重复冻融5次，形成NK细胞裂解液；

S105：挤压：将S104的NK细胞裂解液用LiposofastLF-50，经10um、1um、200nm3个不同孔径的聚碳酸酯滤膜依次挤压5次，形成150nm的NK细胞脂质体样纳米颗粒(NKL)；

S106：合并：把S105的NKL与S102收集的NKS合并形成NKLS，共1500ml；

S107：浓缩纯化：用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维去除NKLS中的细胞代谢小分子产物及NK细胞挤压过程中产生的除脂质体之外的细胞碎片，截留NKE及NKL，并浓缩至300ml，获得80-150nm的NKE及NKL混合物，即NK细胞类外泌体(NKEM)。

2.根据权利要求1所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S101之前，还包括：

S100：制备NK细胞外泌体(NKE)。

3.根据权利要求2所述的NK细胞外泌体(NKE)的制备方法，其特征在于：在所述的S100中，采用LifeTechnology的总外泌体分离(TEI)试剂盒，富集NK细胞培养上清液中的外泌体，包括以下步骤：

S1001：收集NK细胞培养上清液，分装在50ml锥底离心管中，2000Xg离心30分钟；

S1002：把上清液转入两个新离心管，加入0.5倍体积的TEI试剂，彻底混匀，4度孵育过夜，次日10,000Xg离心1小时；

S1003：吸出上清液，把沉淀悬浮在5mlPBS中；

S1004：10,000Xg离心1小时，吸出上清液，把沉淀悬浮在20mlPBS中，即为80-150nm的NKE，分装后-20度保存备用。

4.根据权利要求2所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S100之前，还包括：

S90：NK细胞培养。

5.根据权利要求4所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S90中，包括以下步骤：

S901:采集50ml健康人抗凝外周血；

S902：用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞；

S903：用NK细胞体外培养试剂盒制备NK细胞，按试剂盒说明书在X-Vivo15无血清培养液中添加IL-2及膜嵌合细胞因子，37℃、5％CO₂孵箱培养约14天；

S904：NK细胞计数：用血细胞计数板对培养的HANK细胞计数，1L培养液中共有4.8×10⁹个NK细胞。

6.NK细胞类外泌体(NKEM)的应用，其特征在于，应用上述权利要求1至5任一项所述的NK细胞外泌体(NKE)及NK细胞类外泌体(NKEM)。