[发明专利]NK细胞类外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开的是NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法及其应用。该方法包括：NK细胞培养‑‑制备NK细胞外泌体(NKE)‑‑制备NKEM。本发明制备的NKEM和NKE不仅具有抗病毒、抗癌的作用，而且还有美肤的功效。和NKE相比，NKEM产量更高；把培养的同一份NK细胞平分为2半，分别制备NKE和NKEM，后者的产量是前者的15倍左右。这不但克服了NKE不能大量生产的瓶颈，而且也对其它细胞外泌体产品的产业化具有一定的参考价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及NK细胞类外泌体的制备方法及其应用。

背景技术

NK细胞是机体免疫系统的一个重要成员。NK细胞不但具有直接杀灭并清除衰老、死亡、癌变、感染细胞的杀伤作用，而且还可通过其分泌的多种活性因子发挥重要的免疫调节功能。在临床研究及临床应用中已经充分证明，高活性NK(HANK)细胞不但可以有效地预防早早癌发生及癌症治疗后复发，而且对白血病及多种实体瘤的有效率高达80％以上；不但可以消减癌症负荷，使原发癌及转移癌缩小或消失，而且还能解除癌症疼痛，缓解癌症疲劳；不但可增强机体免疫力，提升T细胞及NK细胞活性及含量，而且还能抑制自身免疫反应，缓解糖尿病、结肠炎及类风湿等多种自身免疫性疾病；不但能治疗亚健康，改善睡眠、提升精力、增强性功能，而且还有显著的美容及美体效果，大多数患者皮肤变得白里透红、面部拉提紧致、容光焕发；增加食欲，减小腰围。NK细胞不但能够抑制病毒(比如西尼罗病毒，WNV)在感染细胞(Vero)中增殖，而且用NK细胞预处理Vero细胞可以使Vero细胞获得抵抗WNV感染的功能。

上述这些NK细胞的众多功能都是通过NK细胞发挥作用的。但是，NK细胞作为活细胞，制备出来后需要在短期(一两天)内使用，若需要保存或运输则必须采用液氮保存和干冰运输，为应用带来了极大的不方便。在寻找解决方案的过程中，虽然考虑到并尝试了多种途径，但其中只有外泌体最符合我们的需求。

外泌体是一种机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30-150nm。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。随着有关外泌体研究越来越多，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长等多种生物过程中。

外泌体是细胞分泌到细胞外的成分，目前主要用于疾病诊断。由于外泌体的产量比较低。至今还无法大量制备，严重制约着其作为药品的产业化。而本发明的类外泌体是根据细胞膜脂质双层与外泌体脂质双层的结构及成分类似的特性，把细胞通过机械挤压形成脂质体样纳米颗粒，并与从细胞培养液中的外泌体合并形成新产物，我们把这种来自同一细胞培养的外泌体与脂质体混合物叫做类外泌体。类外泌体具有和外泌体类似的形态结构及生物学活性，但产量比外泌体大十余倍，从而打通了外泌体不能量产的瓶颈。

发明内容

本发明的主要目的是提供NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法及其应用。此NKEM比NK细胞外泌体(NKE)的产量更高，更适于大规模工业化生产。

为实现上述目的，本发明提出的NKEM的制备方法，包括以下步骤：

S101：分离。把NK细胞培养物转入500ml离心管，2000rpm离心20分钟；上清为NK细胞培养上清液，沉淀为NK细胞；

S102：收集。把NK细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟去除细胞碎片；把去除碎片后的NK细胞培养上清液(NKS)收集在新的容器中，约1000ml，含有大量的NK细胞外泌体(NKE)；

S103：悬浮。用生理盐水悬浮S101沉淀中的NK细胞，离心洗涤一次，再悬浮在生理盐水中，调整NK细胞浓度为2*10⁷/ml，约500ml；

S104：冻融。把S103的NK细胞悬浮液放液氮中快速冷冻，然后37℃水浴充分融解；重复冻融5次，形成NK细胞裂解液；