[发明专利]病原物种特异PCR引物优化设计方法

权利要求书

1.一种病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述方法包括：

1)从NCBI RefSeq/GenBank库中挑选n个目标物种的基因组；

2)对步骤1)中的每一个基因组划分K-mer，分别作unique K-mer集合；

3)对步骤2)中所有unique K-mer集合合并，挑选出频率大于等于n*p的K-mer，构建K-mer比对库；所述n取值1-10；所述p为概率值，取值0.5-1；

4)从步骤1)中的基因组按最佳参考基因组的筛选规则顺序挑选目标物种的参考基因组，并将基因组划分K-mer集合，并记录所有K-mer的位置信息；

5)对步骤4)中的K-mer集合和步骤3)中的比对库作比对，得到有比对结果的K-mer集合，此集合为物种水平共有序列K-mer集合；

6)步骤5)中的物种水平共有序列K-mer集合与背景比对库作比对，获取未比对上背景库的K-mer集合，制备物种特异的K-mer集合；

7)对物种特异K-mer集合根据步骤4)中记录的K-mer位置信息进行合并处理，整理成bed格式，并使用seqtk软件进行特异片段segments序列提取，制备物种特异序列集合；所述bed格式为基因组注释文件格式；

8)对物种特异序列集合作长度L和窗口W片段序列切分，得到(L,W)segments序列集合；

9)调用primer3软件对步骤8中的segments序列作引物设计。

2.权利要求1所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述最佳参考基因组的筛选规则顺序为“reference genomerepresentative genomeComplete GenomeChromosomeScaffoldContig”。

3.权利要求1所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述n取值1-10。

4.权利要求1-3任一所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤2)-3)中所述K-mer中的K取值为18-20。

5.权利要求1-3任一所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤4)-7)中所述K-mer中的K取值为40-60。

6.权利要求1-3任一所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤8)中，当针对Illumina平台、微流控PCR平台作多重PCR反应时，L取值100-1000bp；W取值范围为100-1000bp当针对Nanopore平台作多重PCR靶向富集时，L取值1500-3000bp；W取值范围为1500-3000bp。

7.权利要求1-3任一所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤6)中背景比对库制备方法如下：

a)获取NCBIRefSeq中所有微生物物种水平的参考基因组，对每一个基因组划分K-mer，形成unique K-mer集合，所述K取值为18-20；

b)从微生物物种水平的unique K-mer集合中挑选出频率＝2的K-mer，作为候选K-mer集合，所述K取值为18-20；

c)人基因组按步骤a)切分unique K-mer集合，与步骤b)的微生物物种水平的候选K-mer集合合并，用于构建K-mer db，获得背景比对库；所述K取值为18-20。

8.权利要求1-3任一所述的病原物种特异PCR引物优化设计方法，其特征在于，所述步骤9)中，所述引物设计满足以下任一条件或其组合：1)引物长度在18-25nt；2)GC含量在40-65％之间；3)退火温度Tm值在59-65之间；4)模板扩增长度在80-3000bp之间；5)引物间相互作用的结合自由能阈值ΔG为-4--9kcal/mol；6)引物不能出现超过4个连续重复碱基；7)引物间不能出现超过5个碱基的连续互补。