[发明专利]病原物种特异PCR引物优化设计方法

说明书

本发明提供一种病原物种特异PCR引物优化设计方法。所述引物优化设计方法使用K‑mer法鉴定物种的特异区间，基于特异片段作引物设计，确保了引物的物种特异性，避免了使用单一基因组造成的菌株特异性。

技术领域

本发明涉及生物信息学分析领域，特别是涉及一种特异PCR引物的设计优化方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)作为最基础的分子生物学实验手段之一，能够在体外成百万倍地扩增目标DNA的拷贝数，因而被广泛应用于基因工程、基因诊断、目标序列富集等领域。其中引物设计的优劣是影响PCR试验的重要参数之一。

在临床微生物诊断中，多重PCR检测、Illumina和三代Nanopore高通量平台已成为检测临床样本未知感染的重要检测手段。且近年已有通过PCR方法靶向富集病原区域来提升检测精准度的趋势。在这些检测手段中，设计灵敏、高效、物种特异的PCR引物成为了关键。

针对微生物的PCR引物设计，现有方法主要为：1.基于16ribosomal RNA(rRNA)的引物设计；2.基于多重序列比对，获得同源性保守序列作兼并引物设计。然而这两种方法都有其局限性：1.不同微生物之间16S rRNA基因序列的高度相似性。基于16S rRNA只能在较高的分类水平(例如属和科)而不能在物种/菌株水平上可靠地鉴定微生物。即使在属级，许多研究者也报告了16S rRNA基因序列的分辨率问题，因此16S rRNA设计的引物并不适用于感染样本这种复杂环境中对菌株/物种水平上的微生物进行鉴定。2.基于多重序列比对进行兼并引物设计，1)前期需要大量有关目的微生物的背景知识调研积累；2)重复劳动，针对每一个目的物种，都需要重复构建多序列比对及同源性保守区域筛选；3)获得序列保守性的高低，会严重影响引物设计的灵敏度和特异性，4)兼并引物不能直接进行引物间相互作用的自由能评估，影响湿试验作多重PCR组合反应性能。因此基于多重序列比对设计兼并引物也不适用于大批量感染样本作多重PCR反应进行靶向富集。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种便捷的特异性PCR引物的设计方法，该方法的核心设计思路是：

1.从目标物种多个基因组使用K-mer方法获取物种共有K-mer集合，避免使用单一基因组造成的菌株特异性；

2.基于NCBI RefSeq库使用K-mer方法构建背景比对库，并对目标物种共有K-mer集合作比对，获取不包含在背景比对库中的物种特异K-mer集合，根据K-mer位置信息获取特异区间序列；

3.对物种特异序列作PCR引物设计，引入引物间相互作用的结合自由能阈值ΔG等进行筛选过滤；

4.引物经过与1600个临床微生物基因组作模板结合能力评估，确保引物与目标物种优先结合；

5.构建microbial_nt hash比对库，使用NCBI-ePCR软件获取引物的扩增区间target，提取序列作blast比对，确保引物的物种特异性。

具体的，本发明首先提供了一种病原物种特异PCR引物优化设计方法，所述方法包括：

1)从NCBI RefSeq/GenBank库中挑选n个目标物种的基因组；

2)对步骤1)中的每一个基因组划分K-mer，分别作unique K-mer集合；

3)对步骤2)中所有unique K-mer集合合并，挑选出频率大于等于n*p的K-mer，构建K-mer比对库；所述n取值1-10，优选10；所述p为概率值，取值0.5-1,优选0.8；