[发明专利]靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞的构建方法及应用

权利要求书

1.靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞，其特征在于，所述双靶点CAR-T细胞嵌合抗原受体包括抗CD30单链抗体、抗CD24单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内区；

所述CD30单链抗体包括抗CD30单链抗体的轻链和抗CD30单链抗体的重链，所述抗CD24单链抗体包括CD24单链抗体的轻链和抗CD24单链抗体的重链，所述铰链区包括CD8α，跨膜区包括CD28，胞内区包括CD28，4-1BB和CD3ζ；

所述抗CD30单链抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗CD30单链抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗CD24单链抗体的轻链的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述抗CD24单链抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CD28跨膜区和胞内区的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述4-1BB胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CD3ζ胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，步骤如下：

S1：PTK-hCD30-hCD24质粒构建，依次连接抗CD30单链抗体的轻链、抗CD30单链抗体的重链、抗CD24单链抗体的轻链、抗CD24单链抗体的重链、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区，并合成基因序列片段；将基因序列片段连接至带有酶切位点AgeI和AfeI的慢病毒表达载体PTK881，得到能同时表达CD24和CD30双靶点CAR-T的质粒PTK-hCD30-hCD24，并用柱离心法提取质粒；

S2：慢病毒包装，用DMEM完全培养基培养293T细胞，加入含有PTK-hCD30-hCD24质粒的三质粒包装系统和聚乙烯亚胺，混匀后培养，然后收集细胞培养上清液，过滤得到病毒初始液；

S3：病毒液浓缩，将病毒初始液与PEG8000-NaCl溶液混合，离心，去除上清，向离心管内加入缓冲液，溶解慢病毒，得到病毒浓缩液；

S4：制备T细胞，健康人的外周新鲜血液经缓冲液稀释后加入至淋巴细胞分离液中，离心后，吸取单个核细胞层的液体放入新的离心管中，加入缓冲液，离心弃上清；向残留物中加入RPMI-1640培养基，加入细胞因子及抗体复合物，置于培养箱培养，得到T细胞；

S5：慢病毒感染T细胞，将病毒浓缩液加入制备好的T细胞中，培养转导后得到双靶点CAR-T细胞。

3.如权利要求2所述的靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，步骤S1所述抗CD30单链抗体的轻链前还包括信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述抗CD30单链抗体的轻链和抗CD30单链抗体的重链之间还包括轻重链间隔区，所述轻重链间隔区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述抗CD30单链抗体的重链和抗CD24单链抗体的轻链之间还包括单链抗体间铰链，所述单链抗体间铰链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.根据权利要求2所述的靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述三质粒包装系统中三种质粒及质量比为PTK-hCD30-hCD24:GAG:VSVG＝8:6:2。

5.根据权利要求2所述的靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞的构建方法，其特征在于：步骤S4中，所述抗体复合物是浓度为100ng/mL的Anti-CD3OKT3和浓度为250ng/mL的Anti-CD28。

6.如权利要求1-5任一所述的靶向CD30和CD24的双靶点CAR-T细胞在制备抗淋巴瘤产品中的应用。