[发明专利]一种高效生产茶褐素的液态发酵工艺

说明书

本发明属于微生物发酵工业领域，具体涉及到一种高茶褐素液态发酵工艺。包括如下步骤：(1)碎末茶磨粉；(2)制备茶汤；(3)黑曲霉孢子液制备；(4)液态发酵；(5)终止发酵；(6)茶褐素检测。本发明通过单因素试验得到优化后使茶褐素含量高达28.27％，固态发酵普洱茶熟茶茶褐素含量约为8.33％～13.65％。本发明优点在于生产条件容易控制能实现自动化、效率高和成本低。

技术领域

本发明属于微生物发酵工业领域，具体涉及到一种高茶褐素液态发酵工艺。

背景技术

茶褐素(Theabrownins)是一种水溶性的大分子茶色素，由多种酚类、多糖、蛋白质等物质通过微生物多酚氧化酶和过氧化物酶转化而成。茶褐素具有减肥、调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、提高免疫力等功效。由于茶褐素具有多种生物活性，快速高效获得高茶褐素是当前茶叶科学研究的热点之一。目前茶褐素主要获取从固态发酵的黑茶中提取茶褐素，然而黑茶存在生产周期长、茶褐素含量高低不均、生产过程易污染杂菌等问题。其次利用茶多酚、新鲜茶叶或茶水提物通过酶促法，化学氧化剂不仅会影响茶褐素食用安全性，同时对环境造成一定污染，酶制剂成本高。利用茶叶加工过程中的残次品—碎末茶茶汤接种黑曲霉，建立一种低成本的“微生物液态发酵快速合成茶褐素”的发酵工艺。黑曲霉(Aspergillus niger，AN)属于丝状真菌，被美国食品药品管理局(Food and DrugsAdministration，FDA)认定为安全菌种之一。通过液态发酵制备茶褐素效率高，其生产条件及环境容易控制，易实现自动化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：茶褐素一般主要从黑茶中提取，但目前黑茶多数仍采用传统的固态“渥堆”发酵工序制成，该发酵工艺生产效率低，受自然条件制约严重、生产周期长、茶褐素含量高低不均和生产过程易污染杂菌等问题。本发明通过液态发酵工艺提供一种生产工艺简单、生产条件易控制、发酵成本低和可以显著提高茶褐素含量且适合工业规模化生产。

黑曲霉GZUIFR-Asn20201，来源于贵州大学真菌资源研究所分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏时间：2020年12月14日；保藏号：CCTCCNO:M2020905，分类命名：Aspergillus niger GZUIFR-Asn20201。

本方法采取的技术方案为：一种高茶褐素液态发酵制作方法，该方法包括以下步骤：

1、碎末茶磨粉：利用粉粹机高速磨成40目茶粉。

2、制备茶汤：按1∶25～1∶35的比列将碎末茶茶粉加入到蒸馏水中，于水浴锅中沸水浴15min，沸水浴时需要摇晃3次。茶汤离心弃去茶渣，按蔗糖浓度6％～12％添加到茶汤，冷却后定容。然后80℃水浴30min灭菌，即为液态发酵液。

3、黑曲霉孢子液制备：将黑曲霉在无菌操作下接种于灭菌的PDA培养皿上并在28℃恒温箱中培养7d。通过添加0.9％NaCl无菌溶液，用无菌刀轻轻刮擦，从培养基表面获取黑曲霉孢子。通过血球计数板计算孢子悬液中孢子浓度，调整到大约1×10⁴～1×10⁸CFU/mL。

4、液态发酵：按(3)黑曲霉孢子液浓度在无菌条件下加于上述(2)灭菌茶汤中，摇床的发酵温度为24～32℃和转速为150～210r/min，发酵5-7d生成茶褐素。

5、终止发酵：结束发酵后，通过减压抽滤除去真菌固形物，液体立即进行75℃水浴5min终止发酵，取发酵液进行茶褐素含量检测。

6、茶褐素检测：用移液管分别吸取15mL发酵液和15mL正丁醇放入125mL分液漏斗中，摇振3min,待分层后将水层(下层)放于50mL三角瓶中，取水层液2mL于25mL容量瓶中，分别加2mL饱和草酸和6mL蒸馏水，再用95％乙醇定容到刻度，得溶液。用10mm比色皿，以95％乙醇作为空白参比，在波长380nm处，测定溶液吸光度值(A)。