[发明专利]一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法

说明书

本发明提供一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法，通过第一阶段调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量，并调整一些工艺参数（温度，接种密度）和第二阶段利用DOE实验设计调整酶的辅因子、糖基合成前体等物质的浓度达到调节CHO表达外源蛋白糖型的目的。本发明提供的方法能够在1‑2个月内快速调控目标糖型，对于缩短药物开发时间，满足药物产品质量具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法。

背景技术

糖基化是一种常见且重要的蛋白翻译后修饰，糖链的结构及糖型比例对蛋白生物活性，免疫原性、药物代谢动力学、构象、稳定性及溶解度具有重要影响。考虑到糖基化生物合成及哺乳动物细胞培养的的复杂性，在新药及生物仿制药开发中，快速有效的调控特定糖型仍存在一定难度。

目前，调节糖基化生物合成的方法一是通过对宿主细胞进行基因改造使得糖蛋白生物合成的特定的酶功能受到抑制或缺失达到目的。

专利CN106167525A中将至少一种编码靶向FUT8基因和FUT8基因的Exon1区域的编码区的至少一种TALEN（和/或CRISPR/CAS9）的载体同时引入细胞，抑制FUT8的抗体或IgG-Fc融合蛋白的岩藻糖化水平。专利CN110438083A通过锌指核酸酶靶向失活编码甘露糖基（α-1，3-）-糖蛋白β-1，2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ(MgatⅠ)的染色体序列编码区中2bp-220bp，产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组蛋白。

调节糖基化生物合成方法二是通过对细胞培养工艺的优化来调整，涉及到基础补料培养基的筛选，商业化糖型调剂剂筛选及细胞培养参数（转速，溶氧，pH）的优化。

专利CN104974979A公开了一种调控糖基化修饰的方法，其主要通过调整基础、补料培养基的配比及控制补料培养基比例来实现，但因培养基组分较多，培养基配比筛选及补料比例调节并不能做到对单一组分或某几种组分的精准调节，存在一定的局限性。

提供一种精准高效的方法调节细胞培养工艺以调节糖基化生物合成具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，在不涉及细胞株基因改造的前提下，本发明采用两阶段调控方法，1）利用DOE实验设计对平台培养基库中的基础培养基，补料培养基，补料培养基的比例和/或一些工艺参数（温度，接种密度）进行组合筛选，以期筛选到与目标糖型比例最为接近的培养基和/或工艺参数的组合，2）在筛选组合的基础上，利用DOE实验设计对酶的辅因子，糖基合成前体等物质进行浓度的精确筛选，将目标糖型的比例控制在与目标值附近。

一方面，本发明提供了一种两阶段调节CHO表达外源蛋白糖型的方法。

所述的方法包括第一阶段和第二阶段。

所述第一阶段为调整基础培养基和补料培养基的类型和添加量。

具体地，所述的基础培养基为ActiPro、BalanCDCHO Growth A、Dynamis、AdvanceCHO Fed-batch、EmCD CHO 104、CDM4 CHO中的一种或多种；所述的补料培养基为BalanCDCHO Feed 4、Efficient Feed C plus、Cell Boost 7a、Cell Boost7b、EfficientFeed B plus、Advanced CHO Feed1中的一种或多种。

具体地，所述的补料培养基补料总量为初始培养基的25%-45%（w/w)，补料次数为4-12次。