[发明专利]一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。本发明的方法包括如下步骤：将硫还原地杆菌的生物膜用浓度为体积比0.9％的NaCl溶液将悬浮，得到的生物膜悬浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白质，醇沉法分离胞外多糖，超滤管纯化，得到硫还原地杆菌胞外多糖。本发明的方法保证多糖提取率的同时减少了胞内多糖的含量，在提高胞外多糖的分离率的同时减少无水乙醇的消耗；找到了最适宜的乙醇浓度以及醇沉时间；提取的胞外多糖含有较少的胞内多糖，为胞外多糖在胞外电子传递的研究中提供技术支持。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。

背景技术

多糖是一类高分子化合物，它广泛存在与植物、动物、微生物中，参与能量转运、发育分化、免疫调节等生命活动过程。细菌多糖可分为胞内多糖、荚膜多糖以及胞外多糖，实际的细菌培养中，荚膜多糖和胞外多糖难以区分，故有人将两者统称为胞外多糖。胞外多糖是胞外多聚物的重要组成部分，是细菌生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，是游离于细胞外且能维持胞外基质稳定的粘液状物质，主要有机成分是碳水化合物，蛋白质和腐殖质。胞外多糖有多种提取纯化方法，不同的方法会影响胞外多糖的含量与纯度。

硫还原地杆菌具有高效的胞外电子传递能力，属于自然界中最普遍也是目前最受关注的电化学活性微生物之一，被广泛应用于生物电化学的研究当中。近期研究发现菌毛被敲除后仍然能形成较薄的生物膜和较低的产电，说明胞外多糖会介导生物膜的形成，同时胞外多糖还会锚定更多的细胞色素C，这有利于远距离的胞外电子传递。因此找到高效提取纯化地杆菌胞外多糖的方法对胞外电子传递的研究具有重大意义。本发明提供了一种硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)胞外多糖的提取纯化方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种硫还原地杆菌胞外多糖的提取纯化方法，包括如下步骤：

(1)悬浮：将硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens PCA)的生物膜用浓度为体积比0.9％的NaCl溶液悬浮，得到生物膜悬浮液；

(2)提取和去蛋白：将生物膜悬浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白质；

(3)分离胞外多糖：加入乙醇，醇沉，离心，将沉淀物中加入去离子水，重悬浮，得到胞外多糖溶液；

(4)纯化：将胞外多糖溶液采用超滤管过滤，离心，得到硫还原地杆菌胞外多糖。

步骤(1)中所述生物膜采用微生物燃料电池培养得到。

步骤(2)中所述采用EDTA法粗提取是加入与生物膜悬浮液等体积的2％Na₂-EDTA，混匀，4℃放置4h，5000g、4℃下离心20min，取上清液，过滤，得到粗提液。

所述过滤为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。

步骤(2)中所述Sevag法去除蛋白质：将由氯仿和正丁醇以4：1的体积比配制的Sevag液与粗提液按1：4的体积比混合，剧烈振荡30min，6000r/min离心10min，取上层水层；重复用Sevag法除蛋白5次，直至蛋白质被去除80％。

步骤(3)中所述乙醇用量为体系中浓度为体积比80％；

步骤(3)中所述醇沉为4℃醇沉24h。

步骤(3)中所述离心为6000r/min，离心10min。

步骤(3)中所述去离子的用量为5mL。

步骤(4)中所述超滤管为Millipore 3KD超滤管。