[发明专利]一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物、探针和方法

权利要求书

1.一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针，其特征在于，所使用的扩增ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针分别为：

ETV6-ex4-F:TTTCACCATTCTTCCACCCTG

ETV6-ex5-F:GCCTGAAGAGCACGCCAT

NTRK3-ex14-R:GCAGTGGGCTGGCTGAGTC

NTRK3-ex15-R:AAAGGCTCCCTCACCCAGTT

NTRK3-ex14-P:FAM-CTCACCACTGATGACAGCCACGGG-BHQ1

NTRK3-ex15-P:VIC-TCGCTTCAGCACGATGTCTCTCCTCTTA-BHQ1。

2.根据权利要求1所述的一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物和探针，其特征在于，还包括扩增Actin内参基因的引物和探针，分别为：

Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT

Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。

3.一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的检测方法，包括以下步骤：

(1)抽提外周血中的总RNA并逆转录为cDNA；

(2)以步骤1中的cDNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(ETV6-ex4-F、ETV6-ex5-F、NTRK3-ex14-R、NTRK3-ex15-R)、检测探针(NTRK3-ex14-P、NTRK3-ex15-P)进行同管Real-time PCR扩增，同时扩增内参基因Actin作参照；

(3)根据Real-time PCR结果来分析样本是否有ETV6-NTRK3基因融合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：一例样本的qPCR体系为25ul：2*qPCR MIX 12.5ul、ROX Reference Dye(50*)0.5ul、引物ETV6-ex4-F、ETV6-ex5-F、NTRK3-ex14-R、NTRK3-ex15-R各0.4ul、探针NTRK3-ex14-P、NTRK3-ex15-P分别为0.2ul和0.4ul、灭菌水7.8ul、cDNA模板2ul；内参的qPCR体系为25ul：2*qPCR MIX 12.5ul、ROXReference Dye(50*)0.5u、引物Actin-F、Actin-R各0.4ul、探针Actin-Probe 0.4ul、灭菌水8.8ul、cDNA模板2ul。Real-time PCR反应程序：95℃1min预变性；95℃15s，58℃35s循环40次。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)的结果分析，具体为：在一块板上同时进行内参(Actin)和目的基因ETV6-NTRK3的Real-timePCR：

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct36，为阳性，样本中有ETV6-NTRK3基因融合；36≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性，样本中无ETV6-NTRK3基因融合。