[发明专利]一管式筛查肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的引物、探针和方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光定量PCR技术，一管式筛查肿瘤患者体内ETV6‑NTRK3融合基因的引物、探针和方法，可筛查肿瘤患者体内是否有ETV6‑NTRK3融合基因，对于肿瘤患者及时调整治疗方案、指导拉罗替尼用药、评价治疗效果、预测预后和预防临床复发具有重要意义。

技术领域

本发明属生物技术检测领域，特别涉及一种筛查融合基因的方法，采用探针Taqman实时荧光PCR技术检测肿瘤患者体内ETV6-NTRK3融合基因的情况。

背景技术

恶性肿瘤是目前全球疾病死亡的首位原因，已经成为严重威胁人类健康的一类疾病。近年来，随着高通量基因测序技术如二代测序(NGS)技术突飞猛进的发展，以肿瘤驱动基因为靶点的个体化精准医疗彻底改变了恶性肿瘤的治疗格局，越来越多的分子靶向药物不断涌现。拉罗替尼(larotrectinib)是一种由Loxo Oncology和拜耳公司共同开发的新型口服小分子、高选择性原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase，TRK)抑制剂。2018年11月26日，获得美国食品与药物监督管理局(FDA)批准，用于治疗无已知耐药突变、广泛转移或局部手术治疗效果不佳的NTRK基因融合的儿童和成人实体瘤患者。这是全球第一个获批上市的与肿瘤类型无关的“广谱”抗癌药。

NTRK基因融合在各个癌症类型中均有发现，常出现在先天性纤维肉瘤、先天性中胚层肾癌和分泌型乳腺癌(各90％以上)以及乳头状甲状腺癌(26％)等罕见肿瘤中，对于国内常见的肺癌和肠癌，NTRK融合的比例比较低，分别在3.5％和1.5％，在所有实体瘤中NTRK基因融合的频率约为1％。其中NTRK基因融合最常见的类型为ETV6-NTRK3。

神经营养酪氨酸激酶受体3(neurotrophic tyrosine kinase，receptor type 3，NIRK3)定位于15q25，DNA379.612kb，含有18个外显子。编码神经营养因子3的跨膜受体，相对分子质量94.4×103，含有839个氨基酸。由胞外配体结合区，跨膜区和胞内酪氨酸激酶区组成。在神经系统的生长发育中起重要作用。除神经系统外，造血细胞，上皮细胞和多种软组织肿瘤中也有表达。NTRK3与膜表面的配体结合后，位于膜内侧的酪氨酸残基发生磷酸化并活化，具有激酶的活性。

ETV6(ETS variant gene 6)定位于12p13，DNA长度约300kb，含有8个外显子。编码蛋白相对分子质量为53×103。含有452个氨基酸，是ETS(E-Twenty-six)癌基因转录因子家族中一种序列特异性的转录抑制因子。在染色体移位中，ETV6是一种常见的断裂靶点，

ETV6-NTRK3基因的融合促进了肿瘤的形成。NTRK3与ETV6基因融合在一起，导致NTRK3基因编码的TRK蛋白处于持续活跃状态，引发永久性的信号级联反应，驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。在CFS(先天性纤维肉瘤)及CMN(先天性中胚层肾瘤)中，ETV6-NTRK3融合基因是通过ETV6第5外显子与NTRK3第15外显子融合在一起形成的，通过ETV6的HLH结构与NTRK3的c端结合形成融合蛋白，该融合蛋白能够不依赖配体而具有激酶活性。另外报道的还有ETV6基因第4外显子或第5外显子分别与NTRK3基因第14外显子之间的融合现象。

拉罗替尼主要通过与细胞内TRKC(NTRK3编码)的ATP位点竞争性结合，进而抑制TRK的催化活性和自磷酸化，阻断下游的信号通路传导，从而发挥抗肿瘤的作用。