[发明专利]一种利用反相色谱检测唾液酸的方法

权利要求书

1.一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

S1.对待测的蛋白样品进行脱盐处理，真空浓缩干燥1-2h；

S2.将干燥后的蛋白样品进行酸水解，得到酸水解产物；

S3 .对步骤S2所得酸水解产物进行DMB标记，获得的产物用超纯水稀释，得到经标记的混合物；对不同浓度的唾液酸标准品进行DMB标记，绘制校准曲线；

S4.将步骤S3所得经标记的混合物去除蛋白，得含有唾液酸的溶液；

S5.对步骤S4所得含有唾液酸的溶液上样于色谱柱，进行反相超高效液相色谱检测，获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果；

其中，所述反相超高效液相色谱包括下列条件：

流动相A为乙腈的水溶液，乙腈与水的体积比为9：91、8：92或10：90；

流动相B为乙腈；

流动相梯度洗脱程序为：0-7min，100%A；7-7.1min，100%B；7.1-11min，100%B；11-11.1min，100%A；11.1-20min，100%A；

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×50mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为5μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.18mL/min；

或，色谱柱为ACCQ-TAG ULTRA C18，所述色谱柱的粒径为1.7μm，规格为2.1×100mm；柱温为30℃；进样温度10℃；进样量为10μL；激发波长为373nm；发射波长为448nm；流速为0.2mL/min；

所述的唾液酸为N-乙酰神经氨酸Neu5Ac和N-羟乙酰神经氨酸Neu5Gc。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述的酸水解采用的酸为冰醋酸、盐酸、三氟乙酸或甲酸中的任一种；所述的酸的浓度为2mol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述的DMB标记的步骤为：分别将步骤S2所得酸水解产物、唾液酸标准品置于离心管中，添加标记试剂，涡旋混匀并离心，于50℃金属浴中避光孵育3h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸水解产物、唾液酸标准品与标记试剂的体积比均为1：4。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述的产物与超纯水的体积比为1：19。