[发明专利]一种利用反相色谱检测唾液酸的方法

说明书

本发明属于色谱分析技术领域，具体涉及一种利用反相色谱检测唾液酸的方法。该方法通过对待测的蛋白样品进行脱盐、真空浓缩干燥、酸水解、DMB标记、去除蛋白、反相超高效液相色谱检测，最终获得蛋白样品的唾液酸含量的测定结果。本发明通过改良传统液相系统中的流动相配方和流动相梯度，使得N‑乙酰神经氨酸和N‑羟乙酰神经氨酸在色谱柱上的保留增强，与副产物的干扰峰分离度良好，不影响N‑乙酰神经氨酸和N‑羟乙酰神经氨酸的定量，并且没有干扰峰影响，可以将标准曲线最低点稀释到更低浓度，提高了方法的检测灵敏度，当蛋白样品中唾液酸含量低时仍可准确定量，具有高准确性和高灵敏度的优点。且增加了去蛋白步骤，延长色谱柱使用寿命。

技术领域

本发明涉及色谱分析技术领域，具体涉及一种利用反相色谱检测唾液酸的方法。

背景技术

唾液酸是一类N-乙酰神经氨酸或其酯、其醇羟基的衍生物，位于糖蛋白侧链末端。在治疗性蛋白药物中，由于唾液酸带有较强的负电荷，唾液酸含量直接影响药物的半衰期，无唾液酸或唾液酸含量低的蛋白在人体中更容易被降解，而蛋白的唾液酸含量也可能影响其生物学活性，高唾液酸水平的突变抗体的ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity)活性表现下降。唾液酸的类型对于药物免疫源性也有重要影响，蛋白药物中人源化的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid,Neu5Ac)，无免疫源性；鼠源性细胞所表达的糖蛋白中含有一种非人源化的唾液酸类型N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)，N-羟乙酰神经氨酸可引起免疫副反应。因此，为保证药物的安全性和有效性，建立一个准确的唾液酸定量分析方法，特别是人源化和非人源化唾液酸含量测定是非常重要的。

目前在唾液酸的检测过程中，因唾液酸极性大且紫外吸光度弱，直接检测难度较大，较常用的方法分为两种。第一种是参考药典方法，取适量蛋白样品，加入一定浓度的硫酸或其他酸性试剂，高温条件下将唾液酸水解，之后离心取上清采用阴离子交换色谱柱进行分离紫外检测，进行定量。该方法灵敏度较低，对于目前的药物蛋白具有很大的局限性，仅能对一些唾液酸含量高的融合蛋白进行检测，对于唾液酸含量较少的蛋白无法准确定量。第二种方法是商品化试剂盒(Ludger)收录的检测方法，采用荧光试剂DMB(4,5-亚甲二氧基-1,2–苯二胺二盐酸盐)进行荧光标记，利用反相色谱柱；流速0.5mL/min；流动相A：乙腈：甲醇：水(9：7：84)溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱的洗脱程序为：0-19min，100％A；19-19.5min，10％A，90％B；19.5-23.5min，10％A，90％B；23.5-24min，100％A；24-30min，100％A。该方法的缺点在于：1、流动相中有机相比例较高，N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸在色谱柱上的保留很弱，而DMB标记过程有很多副产物产生，副产物的保留时间与目标峰重叠，干扰了N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸的准确定量；2、酸解释放唾液酸后的蛋白在色谱柱上吸附严重，压力升高，色谱柱使用寿命短。

综上所述，针对蛋白类药物中唾液酸含量，目前尚缺乏高准确性和高灵敏度的检测方法，亟待开发新的检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明为了解决现有检测蛋白药物中唾液酸含量的方法存在准确性低、灵敏度低的问题，提供了一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，通过改良传统液相系统中的流动相配方，降低了流动相中有机相的比例，并调整了流动相梯度，提高了方法的检测灵敏度和准确性；通过增加去蛋白处理的步骤，延长了色谱柱使用寿命。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用反相色谱检测唾液酸的方法，包括如下步骤：

S1.对待测的蛋白样品进行脱盐处理，真空浓缩干燥1-2h；

S2.将干燥后的蛋白样品进行酸水解，得到酸水解产物；