[发明专利]一种全细胞催化生产PAPS的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程技术领域。本发明在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。本发明将源于酿酒酵母的ATP硫化酶基因atps、源于产黄青霉菌的5’‑磷酸腺苷硫酸激酶基因apsk、源于大肠杆菌的无机焦磷酸水解酶酶基因ppa、源于谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶基因ppk，通过不同的载体表达不同的基因，在微生物细胞内的同时合成，得到重组菌。所述重组菌以ATP二钠盐为底物，利用重组菌进行全细胞催化生产PAPS，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。

技术领域

本发明涉及一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是GAG硫酸转移酶催化肝素、硫酸软骨素等合成过程中直接的硫酸基供体。PAPS的生产方法包括发酵法和生物催化法。发酵法以细胞自身代谢途径为基础，通过引入外源基因实现从ATP到PAPS的合成。然而，在正常条件下，细胞内的ATP浓度较低，且其中绝大部分的ATP用于细胞自身的能量代谢，导致最终产量极低。而且发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。

目前，研究人员一般采用体外酶法制备PAPS。体外酶法催化制备PAPS主要包括两种方法：酰基磺酸转移酶催化3,5-二磷酸腺苷(PAP)合成PAPS、ATP硫酸化酶和APS激酶催化ATP制备PAPS。然而，3,5-二磷酸腺苷价格昂贵，酰基磺酸转移酶催化合成PAPS仅在实验室进行小规模试验，不适合工业化生产。ATP硫酸化酶和APS激酶催化存在酶纯化过程复杂，产物抑制等问题，导致PAPS规模化生产受限。目前商品化试剂PAPS采用酶法合成，价格非常昂贵(20559.40元/25mg，纯度仅60％)，远高于硫酸软骨素和肝素。因此，而还缺乏高效、简便、价格低廉的制备PAPS的方法。

发明内容

目前制备PAPS的方法还是局限于利用纯化后的酶进行转化，过程复杂、转化成本高，不利于PAPS的工业化制备。

为实现PAPS的高效合成，本发明在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。这不仅消除了反应副产物抑制，而且提高了底物利用效率。其次，通过提高细胞膜的通透性，实现全细胞转化生产PAPS。这种生产方式，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。

本发明提供了一种重组菌，所述重组菌将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶(ATPS)、5’-磷酸腺苷硫酸激酶(APSK)、无机焦磷酸水解酶(PPA)、多聚磷酸激酶(PPK)同时在宿主菌中表达。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶来源于酿酒酵母；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶来源于产黄青霉菌；所述无机焦磷酸水解酶来源于大肠杆菌；所述多聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒状杆菌。

在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，利用pETDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pRSFDuet-1载体表达PPA和PPK

在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pET Duet-1载体表达PPA和PPK。