[发明专利]一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法

说明书

本发明涉及一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，包括取组织、酶解、制备肠道单细胞悬液、NKA染色。本发明能够实现低成本、快速、高效获得青海湖裸鲤肠道单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于为其他鱼类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为青海湖裸鲤的单细胞、基因功能研究提供重要参考资料。

技术领域

本发明属于鱼类细胞生物学领域，特别涉及一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法。

背景技术

青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)俗称湟鱼，属鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，裸鲤属(Gymnocypris)，是青海湖中重要的经济鱼类，在青海湖生态系统中占据核心地位。青海湖裸鲤是溯河性产卵鱼类，性成熟裸鲤每年4-7月从青海湖溯游到淡水支流泉吉河和布哈河等河道，完成产卵繁殖后，亲鱼及孵化后的幼体再洄游到青海湖。青海湖盐度13～15，碱度26～32mmol/L，pH 9.1～9.5，且由于蒸发和灌溉等因素，湖水碱度逐年升高。生活在湖水中的裸鲤因具有耐盐碱、耐高寒等优良特性而受到关注。研究表明，青海湖裸鲤由淡水过渡到高盐碱湖水的过程中，其呼吸、排泄、免疫及能量代谢等生理生化活动会发生显著变化，通过体内调节来适应盐碱环境。

绝大多数水生生物对水环境中的盐碱度变化较为敏感，高盐度影响水生生物的渗透平衡，高碱度导致水生生物的组织功能损伤、消化酶及免疫相关酶活性下降，且盐度、碱度和pH在对水生生物的生长繁殖、代谢等方面的影响表现出一定的协同作用。目前，有关鱼类鳃和肾在渗透和酸碱调节方面的作用已有较为深入的研究，而最近的研究发现肠道在维持渗透和酸碱平衡中也发挥着重要作用。

鱼类肠上皮细胞类型和功能复杂，除了参与渗透调节的细胞外，还有消化相关细胞、免疫相关细胞、内分泌相关细胞以及呼吸相关细胞。如果分辨和分离出渗透和酸碱平衡相关细胞，对于研究此类细胞的调控机制至关重要。由于Na⁺-K⁺-ATPase(NKA)在渗透调节和酸碱平衡过程中发挥着重要的作用，大部分参与渗透和酸碱调节的细胞表现为NKA阳性。筛选NKA阳性细胞能够解决肠上皮离子调节细胞类型难以分辨的难题，有助于从单细胞水平上揭示裸鲤肠道的渗透调节和酸碱平衡机制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，该方法有助于快速、高效解离青海湖裸鲤肠道单细胞，制备高质量的单细胞悬液，进而通过NKA抗原抗体免疫反应进行染色，对于鱼类细胞的解离、分离纯化以及渗透调节阳性细胞的筛选具有重要的应用价值。

本发明提供了一种用于青海湖裸鲤肠道单细胞水平NKA蛋白染色的方法，包括：

(1)取青海湖裸鲤肠道新鲜组织，冲洗，然后放入含D-PBS缓冲液的离心管中离心，随后加入肠道组织消化酶混合液酶解消化，得到组织消化液；

(2)将步骤(1)得到的组织消化液过滤、离心、重悬，得到肠道单细胞悬液；

(3)将步骤(2)得到的肠道单细胞悬液滴加到载玻片上，待沉降吸走细胞悬液，随后固定、封闭肠道单细胞，分别加入NKA一抗、二抗染色，最后荧光显微镜拍照即可。

所述步骤(1)中的D-PBS缓冲液不包含钙离子、镁离子和酚红。

所述步骤(1)中的肠道组织消化酶混合液组成为：0.1-0.5mg/ml胶原酶Ⅰ、0.04-0.08mg/ml胶原酶Ⅱ和0.1-0.5mg/ml胶原酶Ⅳ，溶剂为D-PBS缓冲液。

所述步骤(1)中的酶解消化时间为15-30min。

所述步骤(2)中的重悬采用预冷的D-PBS缓冲液，D-PBS缓冲液中还包含2％胎牛血清(FBS)。