[发明专利]一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法

说明书

本发明涉及一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法，其中该方法采用一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条进行孵育及读数，具体还涉及一种中药材及饮片中黄曲霉毒素含量的测算方法，该测算方法能够稳定检测多种黄曲霉毒素含量。本发明提供的方法使不同种类中药材及饮片中黄曲霉毒素在使用不同批次的抗原或抗体检测中保持稳定结合，批间和批内变异系数均小于10％。本发明方法的检测结果十分稳定，且准确度和灵敏度高。

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素检测的领域，尤其是涉及一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法。

背景技术

黄曲霉毒素(AFLA)是黄曲霉和寄生曲霉等产生的有毒的次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和代谢物M1和M2。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物，是目前已知真菌毒素中毒性最强的，可引起肝脏的急慢性损害，同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害，并具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强。在食品或药品中，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2通常是共存的，且后三种黄曲霉毒素也对人体健康有危害作用，如致癌性、致畸性等。黄曲霉毒素分布广泛，中药中的种子、果实、粮谷类、发酵类、动物类、油性成分多的中药材容易产生黄曲霉毒素，且在采收、加工、储存以及销售各过程中都很容易被污染。多篇调查结果表明，国内中药材黄曲霉毒素污染普遍，污染率在82％～100％，污染水平在0.12～202.00μg·kg^－1，其中陈皮、麦冬、当归、薏苡仁、胖大海、神曲等药材污染报道较多。2019年全国中药材种植面积约7000万亩，中药工业总产值达到8000亿元。中医药在此次抗击新冠肺炎疫情过程中发挥了巨大的作用，临床总有效率达到90％以上。因此，中药材质量安全问题不容忽视。

黄曲霉毒素的检测方法主要包括仪器方法、酶联免疫法(ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器方法包括高效液相色谱法、液质联用等，此类方法准确度、灵敏度和精密度高，但是需要昂贵的仪器和试剂，检测成本较高、耗时长、操作复杂，对操作人员的技术水平要求高，在实际应用过程中有很大的限制性，不适宜现场快速检测；酶联免疫法(ELISA)特异性好，灵敏度高，但操作步骤繁琐，检测时间通常为30-120分钟，并且存在基质效应，样品前处理复杂，只能应用于实验室，随着胶体金试纸条的广泛应用，该方法的应用越来越少。而胶体金试纸条法操作简单，检测速度快，特异性和灵敏度高，成本低，非常适用于基层、企业进行现场快速筛查。但是传统的胶体金试纸条在使用时，需要撕开包装，使得试纸暴露在空气中，出现以下问题：首先，试纸与试剂的反应过程暴露在空气中，不仅会发生氧化反应，而且随着反应的进行，样品会发生挥发，使样品体积发生变化，从而降低检测数据的准确度。其次，试纸条暴露于空气中，容易使试纸条受潮，导致试纸条失效。另外，试纸条的检测区域(T线和C线区域)易被污染，一旦手指触碰到检测区域，会影响结果判读，需要重新检测；黄曲霉毒素本身没有免疫原性，不能单独激发动物免疫系统产生抗体，因此需要与大分子载体蛋白进行偶联，获得人工免疫抗原，导致黄曲霉毒素的抗原制备过程比较复杂。相应的，黄曲霉毒素的高效特异性抗体的制备工序也很繁杂。目前，即使是同一来源的用于黄曲霉毒素检测的抗原/抗体，不同生产批次间也普遍存在免疫结合的不稳定性。这就导致了检测人员采用不同批次的抗体或抗原检测黄曲霉毒素含量时获得的结果相差较大。因此，亟需一种能够稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的方法。

目前用于胶体金免疫层析快速检测的定量分析模式主要有T线值法、T/T0法、T/(T+C)法和T/C法等。这些方法均是通过检测3-6个浓度的标准品，根据T线和C线的发光强度，计算出T/(T+C)或T/C值，以获得数值和标准品浓度绘制标准曲线。检测结果受样品基质和反应环境的影响非常大，并且对于每批次试纸条均需要输入标准曲线。因此，开发一种不受样品基质影响、结果准确的测算方法非常必要。

发明内容

为了克服现有方法的不足，本发明一方面提供一种能够稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的免疫试纸快速检测方法。

还有，本发明还另外提供一种改良的提取中药样品中黄曲霉毒素的方法，从而在后续检测中尽多地消除本底。