[发明专利]一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法

权利要求书

1.一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法,其特征在于，包括以下步骤：

S1、前期准备：取七日龄以内的颅骨组织，清洗后将颅骨组织剪碎成组织块；

S2、酶分消化：将组织块置于离心管中，通过胰蛋白酶和I型胶原酶分步对组织块进行消化，直至组织块松散成胡絮状；

S3、细胞培养：向离心管内加入培养液后静置，每隔1-3天采取半换液方式进行换液，直至细胞从组织块周边生长出来，再更换培养液并废弃组织块；

S4、细胞纯化：通过差速贴壁法去除步骤S3中离心管中的成纤维细胞，即可得到纯化的成骨细胞。

2.根据权利要求1所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，步骤S2的酶分消化的具体过程如下：

1)将步骤S1中体积一致的组织块分别转移至一离心管内，向离心管中加入5-6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于恒温水浴锅中进行振荡消化，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，离心后移除上层溶液，采用PBS溶液清洗；

2)清洗完成后，再加入5-6倍于组织块体积的I型胶原酶，在恒温水浴锅中继续振荡消化，离心后弃去上层溶液；

3)重复上述步骤2)，直至组织块松散成胡絮状。

3.根据权利要求2所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，步骤1)中,振荡消化的时间为20-40min；步骤2)和步骤3)中，振荡消化的时间为15-25min。

4.根据权利要求2所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，所述恒温水浴锅的温度为34-37℃。

5.根据权利要求1所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，步骤S1中，所述组织块的大小为1-3mm³。

6.根据权利要求1所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，步骤S3中，所述半换液方式为：

使用胶头滴管吸取离心管内的细胞培养液1ml并废弃，再加入1ml新的培养液至离心管中。

7.根据权利要求1所述的酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，其特征在于，步骤S4中，所述差速贴壁法的具体过程为：

吸取离心管中旧培养液并弃去，每隔24-36h进行换液,用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，加入等量的培养液终止消化，吹打瓶壁与壁角的细胞使之分散，形成细胞悬液；

离心管转入六孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养后，将培养液与离心管内未贴壁的细胞从离心管吸出，离心加入细胞培养液，垂悬后再转入新的六孔板中，并于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，培养所得细胞即为纯化的成骨细胞。