[发明专利]一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法

说明书

本发明提供一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，包括以下步骤包括以下步骤：S1、前期准备：取七日龄以内的颅骨组织，清洗后将颅骨组织剪碎成组织块；S2、酶分消化：将组织块置于离心管中，通过胰蛋白酶和I型胶原酶分步对组织块进行消化，直至组织块松散成胡絮状；S3、细胞培养：向离心管内加入培养液后静置，每隔1‑3天采取半换液方式进行换液，直至细胞从组织块周边生长出来，再更换培养液并废弃组织块；S4、细胞纯化：通过差速贴壁法去除步骤S3中离心管中的成纤维细胞，即可得到纯化的成骨细胞。本发明使用的培养方法使分离的成骨细胞的细胞纯度相比于对比例大幅度得到提升，且同时细胞培养所需的时间也大大缩短。

技术领域

本发明属于细胞分离鉴定领域，具体涉及一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法。

背景技术

骨的生长和发育是骨形成和骨吸收之间动态平衡过程，而成骨细胞决定着骨的生长和发育、以及影响着骨的发生和形成，对骨基质里面的胶原和糖蛋白的合成与分泌起到了非常重要的作用，而且成骨细胞能够保持动物机体细胞外液各种理化因素的相对稳定、协调动物机体内的各种生理机制和生命活动，对治疗各种由骨引起的疾病或疫病起到了及其重要的作用，成骨细胞在体内主要来源于骨膜和骨组织，培养成骨细胞的标本有很多，主要来源有人胚、大鼠、小鼠和兔，将鼠作为标本既经济实用又不难获得,乳鼠颅骨的成骨细胞活动也及其地活跃，表现出了良好的增殖能力，而且新生乳鼠颅骨收集的细胞数量较多,所以我们在实验中选择乳鼠作为标本分离培养成骨细胞。

对成骨细胞进行研究，建立正确的成骨细胞分离培养方法，对骨组织代谢的探究具有关键的作用，是骨组织工程以及骨组织代谢形成机制的基础，由于成骨细胞存在于致密的组织中，导致成骨细胞难以完全分离，造成分离培养出的成骨细胞纯度不一，而单纯酶消化法或单纯的组织块培养法，其分离出的细胞数量有限，或者细胞纯度低，不能满足实验的需求，因此，建立何种分离培养方法显得十分重要。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现：

一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，S1、前期准备：取七日龄以内的颅骨组织，清洗后将颅骨组织剪碎成组织块；

S2、酶分消化：将组织块置于离心管中，通过胰蛋白酶和I型胶原酶分步对组织块进行消化，直至组织块松散成胡絮状；

S3、细胞培养：向离心管内加入培养液后静置，每隔1-3天采取半换液方式进行换液，直至细胞从组织块周边生长出来，再更换培养液并废弃组织块；

S4、细胞纯化：通过差速贴壁法去除步骤S3中离心管中的成纤维细胞，即可得到纯化的成骨细胞。

进一步地，步骤S2的酶分消化的具体过程如下：

1)将步骤S1中体积一致的组织块分别转移至一离心管内，向离心管中加入5-6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于恒温水浴锅中进行振荡消化，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，离心后移除上层溶液，采用PBS溶液清洗；

2)清洗完成后，再加入5-6倍于组织块体积的I型胶原酶，在恒温水浴锅中继续振荡消化，离心后弃去上层溶液；

3)重复上述步骤2)，直至组织块松散成胡絮状。

进一步地，步骤1)中,振荡消化的时间为20-40min；步骤2)和步骤3)中，振荡消化的时间为15-25min。

进一步地，所述恒温水浴锅的温度为34-37℃。

进一步地，步骤S1中，所述组织块的大小为1-3mm3。

进一步地，步骤S3中，所述半换液方式为：