[发明专利]用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒

说明书

本发明涉及单抗血药浓度检测，具体涉及一种用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒。所述人工抗原包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。所述试剂盒包含所述人工抗原。本发明提供的人工抗原或试剂盒能够灵敏、准确地检测血清样品中利妥昔单抗的浓度，可用于提供准确的治疗药物监测数据，从而实现利妥昔单抗药物的精准治疗。

技术领域

本发明涉及单抗的血药浓度检测，具体涉及一种用于利妥昔单抗血药浓度检测的人工抗原及试剂盒。

背景技术

随着单抗药物的深入研发和临床使用，临床问题也逐渐显现，不同个体对于单抗药物的响应程度有显著差异，初始治疗反应的比率在40％～90％，同样也有一部分初始治疗有反应的患者在治疗过程中出现响应丢失的情况，导致疾病进展。目前对于初始治疗无响应的具体机制仍然了解得不够清晰，影响因素也较多，比如表观遗传、病理机制、免疫原性等。治疗响应的个体差异及响应丢失被认为与血清中单抗药物浓度以及药物使用后免疫原性等因素相关，因此，基于治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)进行剂量优化可为单抗药物精准治疗提供有效的手段。药物浓度检测是TDM实践的一个重要环节，对于单抗药物通常采用免疫学平台检测，目前采用最多的方法是酶联免疫法。用于单克隆抗体药物TDM的反应模式，在酶标板上包被单克隆抗体体内作用靶点的重组蛋白，加入单克隆抗体药物与抗原结合，再加入酶标记的抗人IgG抗体与抗原结合，加入酶催化底物TMB，加入终止液终止反应，即可根据吸光度测定来检测单抗药物浓度。

利妥昔单抗注射液(商品名：美罗华)作为最早应用于临床的CD20单抗类药物，广泛应用于CD20阳性的淋巴瘤患者。早在利妥昔单抗临床开发阶段，在低恶性度淋巴瘤患者中便观察到不同响应的患者体内的药物浓度有所差异，初次给药后达到临床缓解的患者体内的药物浓度(71.3μg.mL^-1)要高于无响应者(57.9μg.mL^-1)，经过4次给药后临床缓解患者体内的药物浓度(206.2μg.mL^-1)远高于未缓解群体(129.1μg.mL^-1)。因此，对利妥昔单抗进行准确治疗药物监测(TDM)对于利妥昔的治疗效果是非常重要的。

利妥昔单抗(rituximab)是人鼠嵌合抗体，由鼠抗CD20单抗的可变区Fab和人IgG1抗体稳定区Fc片段构成，含1328个氨基酸残基，相对分子量约144×10³Da。广泛用于B细胞淋巴瘤的治疗，由IDEC公司研发，是第一个获准用于临床治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单抗。除此之外，已获批准的适应症还包括类风湿性关节炎、类风湿性关节炎继发症、慢性淋巴细胞白血病、韦格纳肉芽肿和显微镜下多血管炎。利妥昔单抗自1997年被美国FDA批准上市后销量逐年增加，2018年销售额为67.52亿美元，名列全球抗肿瘤药物销量前茅。利妥昔的作用靶点为CD20，CD20是人类B淋巴细胞表面特有的标识，由297个氨基酸残基组成，相对分子质量约为33×10³Da，属于非糖基化磷蛋白，对B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用。CD20在循环的B细胞上普遍表达，具有四个跨膜螺旋，带有两个细胞外环ECL1和ECL2，第二个更长，并含有二硫键。

虽然利妥昔单抗已经成功应用于临床，但人们对于利妥昔作用于CD20的具体抗原位置以及利妥昔是如何激活补体以杀死B细胞仍然知之甚少。其中可以明确的是，利妥昔并非作用于CD20抗原的单个线性表位，而是作用于CD20的跨膜区域的多个抗原表位。2020年2月，Genentech在Science上发表的一篇文章中突破性地解析了全长CD20蛋白以及CD20蛋白与利妥昔单抗复合物的三维结构。文章证实利妥昔单抗对CD20的识别不止有一级表位ECL2，还可识别其二级表位ECL1/ECL2。其他体外研究结果证明，用原核或真核表达的CD20全长蛋白作为抗原，在体外无法与利妥昔单抗反应，因此无法用于利妥昔单抗的药物浓度监测(TDM)。

发明内容