[发明专利]一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法

说明书

本发明涉及一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法，包括以下步骤：1)挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1‑1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15m in；2)移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；3)将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；4)将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；5)利用Image‑ProPlus6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％作为血栓发生程度的指标；本发明的有益效果是试剂便宜，成模率稳定，成膜效果好。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种利用氯化铁制备斑马鱼血栓模型的方法。

背景技术

血栓形成是由遗传和环境多重因素引起，可发生于动脉和静脉内，静脉血栓多为红血栓会引起肢体肿胀、疼痛，静脉血栓脱落可进入肺循环，引起肺动脉栓塞，严重者会有呼吸困难，甚至死亡，动脉血栓多为白血栓，会引起肢体和重要脏器的缺血改变，动脉血栓脱落可以顺血流堵塞于远端动脉，引起肢体或器官坏死，血栓对人体的危害较大，需要积极治疗，目前，因为社会压力大、环境污染严重、不良生活方式等原因，血栓形成的年轻化趋势日益加剧。

斑马鱼胚胎透明，体外发育，是研究血管性疾病的良好模型。目前，斑马鱼血栓模型研究的较少，可选择的方法不多，本发明的目的是提供一种新的斑马鱼血栓模型制备方法。

发明内容

经过氯化铁处理后，血管内皮细胞上会聚集许多高铁离子形成的聚集物，这些聚集物会附着血小板，从而形成血栓。本发明的制备过程如下：

1.挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.1-1.1％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；

2.移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；

3.将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；

4.将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；

5.利用Image-Pro Plus 6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为血栓发生程度的指标；

其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.4mmol/L CaCl₂，0.16mmol/L MgSO₄；

其中，邻联茴香胺染色液配方：含0.6mg/mL邻联茴香胺，0.01mol/L醋酸钠，0.65％H₂O₂，0.16mmol/LMgSO₄。

优选的，本发明动物模型的制备方法，包括以下步骤：

1.挑选发育正常的2dpf斑马鱼30条左右，移入用胚胎培养水配制的0.7％氯化铁溶液，置于培养箱内培养48h后，吸弃培养水，用邻联茴香胺染色液于6微孔板中避光染色15min；

2.移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；

3.将斑马鱼转入新的6微孔板中，加入等体积DMSO；

4.将斑马鱼置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存；

5.利用Image-Pro Plus 6计算斑马鱼躯干部及血栓染色面积，(血栓染色面积/躯干面积)×100％值作为血栓发生程度的指标；

其中，斑马鱼培养用水配方：5mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.4mmol/L CaCl₂，0.16mmol/L MgSO₄；