[发明专利]耐热β-半乳糖苷酶的制备

权利要求书

1.耐热β-半乳糖苷酶的制备，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第2010位，由原来的A分别突变为C，构建方法包括以下步骤：

1)从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；

2)质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；

3)易错PCR扩增与突变文库的构建

以步骤2获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn²⁺，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg²⁺,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli BL21；

4)突变文库的高通量筛选

将步骤3得到的转化E.coli BL21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/mL)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/mL氨苄青霉素的100mLLB培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经XbaⅠ酶切后电击转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有X-gal的MM培养基上，使X-gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入YPD培养基500μL、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μL BMMY培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；

5)酶蛋白纯化

配制AKTA使用的缓冲液，其中A液：20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化钠溶液(20mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH 7.5)，以5倍柱床体积的A液平衡柱子后，粗酶液经A液流入captorQ(1mL)阴离子柱中，通过B液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的B液洗脱杂蛋白，再以5％B液洗脱目的蛋白；

6)粗酶液中蛋白含量的测定

标准曲线绘制：以牛血清蛋白(BSA)为标准品，配置10mg/mL BSA母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同浓度BSA溶液或超纯水40μL，加入5倍稀释后的Bio-Rad考马斯亮蓝蛋白染液260μL，震荡混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μL，加入稀释后染液260μL，混匀后室温静置15min，取200μL加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；

7)酶活及比活力测定

配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10mL，各取2mL，加入2mL 1mol/L Na₂CO₃溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚-光密度标准曲线；

将200μL稀释的酶液加入到800μL2.5g/L经预热的ONPG(pH6.5，1mM磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下反应10min，加入1mL 10％Na₂CO₃溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为Y＝aX+b；

E:酶活，单位U/mL

t:反应时间

N:酶液稀释倍数

V₂：反应终体积

V₁：酶液添加量

8)将比活最高的突变子，送生物公司测序。

2.根据权利要求1所述的耐热β-半乳糖苷酶的应用，其特征在于，所述的耐热β-半乳糖苷酶应用于医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域。