[发明专利]耐热β-半乳糖苷酶的制备

说明书

本发明涉及耐热β‑半乳糖苷酶的制备，酶基因序列(β‑galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第2010位上发生突变，由原来的A分别突变为C，其有益效果在于，获得的突变β‑半乳糖苷酶最适反应温度大大提高。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及耐热β-半乳糖苷酶的制备。

背景技术

乳糖不耐症是一种乳糖消化不良疾病，主要原因是生物体内缺乏乳糖酶或其活性较低，乳糖不能被乳糖酶水解成单糖，人体无法吸收，我国成年人乳糖吸收不良的发病率高达86.7％。

乳糖酶又称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，乳糖酶的应用领域很广，在医药、乳制品、免疫分析检测、化学合成、生物、环保领域都有应用。目前公认制备乳糖酶比较安全的菌株主要有益生菌、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉、脆壁克鲁维酵母。

国内外已经对乳糖酶进行了大量的研究工作，但尚未得到广泛应用，主要原因有：1.乳糖酶的单位产量较低；2.市场上的乳糖酶多为胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取纯化工艺复杂，成本高；3.酶的作用温度低、耐热性差，工业生产中容易染杂菌，适用范围窄。本研究主要通过提高乳糖酶的酶活，解决乳糖酶的成本问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热β-半乳糖苷酶的制备方法，使得β-半乳糖苷酶的最佳作用温度有很大的提高，其具有更高的应用潜力和经济价值。

本发明的制备过程如下：

1.从NCBI上获得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，设计PCR引物F:5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反应结束后，加20μlCloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；

2.质粒DNA的提取

将携带有质粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Am p(Amp终浓度100μg/mL)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；

3.易错PCR扩增与突变文库的构建