[发明专利]一种绒山羊毛囊毛乳头细胞分离培养的方法

说明书

本发明公开了一种绒山羊毛囊毛乳头细胞分离培养的方法，属于生物学技术领域。本发明的实验方法包括：(1)取绒山羊颈背部皮肤，显微镜下分离初级毛囊和次级毛囊，分别置于0.2％Ⅱ型胶原酶中消化一段时间；(2)分离获得初级毛囊毛乳头和次级毛囊毛球部；(3)将初级毛囊毛乳头和次级毛囊毛球部固定于培养皿中，加入培养液进行培养；(4)剔除次级毛囊毛乳头细胞培养过程中的毛母质细胞，用胰蛋白酶于37℃消化4分钟，收集毛乳头细胞。该发明相比于现有技术显著提高了细胞的贴壁率，并确保了高纯度的毛乳头细胞，为类似较小的毛囊毛乳头细胞的高效分离培养方法提供参考。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种辽宁绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法。

背景技术

羊绒和粗羊毛共同组成绒山羊的被毛，分别由次级毛囊和初级毛囊生长而成。次级毛囊的生长呈现季节周期性变化，生长过程包括三个时期：毛发快速生长的生长期(anagen)、毛发逐步停止生长的退行期(catagen)和毛发完全停止生长的休止期(telogen)。

毛乳头是位于毛囊真皮层的一团特化的成纤维细胞，在毛囊形态发生过程和周期转换过程中具有极其重要的作用，是毛囊的“信号中心”(Karlsson等，1999；Kulessa等，2000)。毛囊从休止期进入生长期依赖于毛乳头与毛囊干细胞之间信号的相互作用，处于静止状态的毛囊干细胞被毛乳头细胞激活，开始新一轮的毛囊生长周期(Morgan等，2017)。在退行时期，毛乳头细胞随着毛根部一起向上移动，直至休止期毛乳头上移至包含毛囊干细胞的隆突部附近，此时毛乳头也进入一个相对静止的状态。

毛乳头细胞不仅对毛囊的周期生长具有调控作用，对毛发纤维的粗细和毛囊的大小也具有调控作用，从而直接影响羊绒的质量与产量(Toyoshima等，2017；Morgan，2014)。毛乳头细胞的研究已逐渐成为毛囊研究的关注热点。绒山羊与其他动物不同，具有产绒的较小次级毛囊，次级毛囊的毛乳头体积明显小于初级毛囊毛乳头，在分离培养过程中具有极大的挑战性。

目前对于毛乳头细胞的分离方法常用的有显微解剖法和酶消化法。对于绒山羊毛乳头细胞的分离，显微解剖法分离的效率较低，细胞贴壁时间较长不易溢出；酶消化法需要大量的皮肤样本以及长时间的消化过程，影响细胞活性状态，并且容易产生大量组织碎片，毛乳头细胞收集较为困难。上述两种分离方法的成功率均较低。因此，现急需研究开发一种操作简便、细胞纯度高以及培养成活率高的绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供了一种绒山羊毛囊毛乳头细胞的分离培养方法，分别进行初级毛囊和次级毛囊两种不同毛乳头细胞的分离和培养。初级毛囊在显微镜下结构较为清晰，在分离时结合酶消化法和机械法可以得到较纯的毛乳头。而次级毛囊较小，成簇排列，在显微镜下无法准确分离毛乳头，导致在培养过程中可能掺杂包裹在毛乳头外围的毛母质细胞，从而无法得到纯度较高的细胞。针对以上问题，我们设计了一种在培养过程中能够彻底清除毛母质细胞进而获得高纯度毛乳头细胞的培养方法，并且优化实验步骤提高毛乳头细胞的贴壁率。此方法相较于现有技术，更加精细且高效，此方法培养的绒山羊毛囊毛乳头细胞贴壁率可达95-100％，成功率高达99-100％。

本发明所采用的具体技术方案为：

一种辽宁绒山羊皮肤毛囊毛乳头细胞分离培养的方法，包括如下操作步骤：

(1)将采集的绒山羊颈背部皮肤用预冷的生理盐水冲洗干净，再进行消毒处理，于体式显微镜下分离绒山羊的初级毛囊和次级毛囊；

(2)将步骤(1)所得的初级毛囊和次级毛囊分别置于0.2％Ⅱ型胶原酶中消化处理，然后终止消化；

(3)于显微镜下切下初级毛囊毛球部，并用注射器针头将毛乳头分离出来；于显微镜下切下次级毛囊毛球部；

(4)用注射器针头将步骤(3)中所得到的初级毛囊毛乳头以及次级毛囊毛球部，固定于培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养；