[发明专利]黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置

权利要求书

1.黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：现场提取样品的DNA，以所述DNA为模板，利用黄曲霉菌的RPA引物进行RPA快速扩增，获得DNA扩增产物，根据所述DNA扩增产物的荧光现象判断样品中是否存在黄曲霉菌污染，所述DNA的提取方法为：

步骤a、洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝；

步骤b、合并所述步骤a中所得的洗涤液，抽滤，得到滤饼；

步骤c、用NaOH溶液重溶所述步骤b中获得的滤饼，将重溶液研磨，取研磨后的溶液稀释于TE缓冲液中，完成DNA的提取，所述步骤a中洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝的方法为：无菌称取颗粒状的样品置于一次性注射器内，吸取无菌水后，剧烈震荡，将水排出，再次吸取干净的无菌水，震荡，将水排出，重复2-3次；

其中，所述黄曲霉菌的RPA引物包括：

正向引物，所述正向引物为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：

5’-GCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATC-3’；

反向引物，所述反向引物为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列：

5’-CCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACG-3’。

2.如权利要求1所述的黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，所述RPA快速扩增的方法为：

取2 μL DNA模板、0.3 μM正向引物、0.3 μM反向引物、29.5 μL反应缓冲液、1 μLCelfinder^TM荧光染料和超纯水加入RPA酶冻干粉反应管中，取2.5 μL醋酸镁加入到反应管的盖子内表面，旋紧盖子混匀后，将反应管置于36±1℃的条件下反应10 min，即获得DNA扩增产物。

3.如权利要求1所述的黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，将所述DNA扩增产物置于蓝光灯下观察其绿色荧光现象，若有荧光，则样品中存在黄曲霉菌污染，且荧光越强污染程度越重；若无荧光，则样品未被黄曲霉菌污染。

4.如权利要求1所述的黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，所述样品的采样方法为：

对于无包装散堆食品，按三层五点法进行代表性取样，根据样品面积大小划分为若干方块，每块为一区，每区按上、中、下分三层，每层设中心、四角共五个点，按区按点，先上后下用取样器各取少量样品；

对于有完整包装的食品，按公式

确定取样件数，进而进行采样，式中：n为取样件数，N为总件数。

5.如权利要求1所述的黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，所述步骤b中抽滤过程采用便携式抽滤器完成，所述步骤c中研磨过程采用简易研钵完成；

所述便携式抽滤器包括：上筒体、下筒体和微孔滤膜，所述上筒体的一端旋接有上端盖，另一端的内壁连接设置有直径逐渐减小的收口，所述下筒体的一端旋接有下端盖，另一端内径向设置有网格，所述下筒体靠近所述网格的一端侧壁上开设有抽滤口，所述上筒体的直径大于所述下筒体的直径，所述下筒体的直径大于所述收口的小口端的直径，所述上筒体扣接在所述下筒体上方，所述网格上放置微孔滤膜，所述收口的小口端压在所述微孔滤膜的上表面；

所述简易研钵包括由水砂纸制成的盒体和钵杵，所述钵杵由水砂纸折叠而成；

其中，所述上筒体用于盛放所述洗涤液，所述抽滤口与一次性注射器的注射口相匹配，所述注射口插接在所述抽滤口外周，利用一次性注射器进行抽气；

所述水砂纸制成的盒体用于盛放重溶液，利用水砂纸折叠而成的钵杵进行研磨。

6.如权利要求5所述的黄曲霉菌的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜的直径为25mm，孔径为0. 8 μm。