[发明专利]黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置

说明书

本发明公开了一种黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置，所述RPA引物和试剂盒特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明还提供了一种能够现场化快速检测食品中黄曲霉菌的方法和装置，黄曲霉菌的检测方法包括以下步骤：现场快速提取样品的DNA，以所述DNA为模板，利用RPA引物进行RPA快速扩增，获得DNA扩增产物，根据所述DNA扩增产物的荧光现象判断样品中是否存在黄曲霉菌污染。所述黄曲霉菌的检测装置，包括自制便携式抽滤器和简易研钵。本发明所述DNA提取方法快速高效，结合体温下就能进行的RPA快速扩增，实现了37℃等温条件下，30min准确、快速、高效地检测到黄曲霉菌，同时对实验场所要求简单，不需要复杂仪器，十分适合基层样品抽检。

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置。

背景技术

黄曲霉菌(Aspergillus flavus)是真菌的一种，以寄生或腐生方式生存。其特点是菌丝体较为发达，无较大的子实体。黄曲霉菌可产生孢子进行繁殖和传播，其在温暖潮湿的环境下繁殖迅速。黄曲霉菌可在作物的种植、收获、储藏、运输和加工等各个环节进行侵染，使食品发生霉变失去食用价值，造成了巨大的浪费和经济损失。同时在其生长过程中可产生有毒的次级代谢产物——黄曲霉毒素。黄曲霉菌和其产生的黄曲霉毒素对食品安全和人类健康带来了巨大威胁，也越来越引起人们的关注和重视。因此建立快速检测方法，掌握食品中黄曲霉菌的污染情况以便及时采取控制措施，对控制黄曲霉菌污染的扩散具有积极意义。

目前，针对食品中黄曲霉菌的快速检测技术较少。传统的检测方法主要依赖于形态学特征观察和鉴别培养基的鉴定，按照真菌的形态、生理特点、培养条件、产生毒素的种类等特征加以区分对比，但这种方法操作繁琐、检测周期长且灵敏度差，其检测结果受操作人员的主观影响较大，存在一定的误检率。随着生物化学、遗传信息学及分子生物学等的飞速发展，人们对产毒真菌的产毒机制认识日益深入，越来越多的分子生物学、免疫学的鉴定方法被应用于霉菌的检测方面，但这些方法仍存在着检测时间较长，依赖昂贵的实验仪器等限制，不能满足快速检测的需求。因此，需要一种灵敏、快速、现场的检测方法。

重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)是一种快速、灵敏的核酸等温扩增技术。在RPA反应中，重组酶/引物复合物通过扫描模板DNA以寻找同源序列，在链置换DNA聚合酶(Bsu)的作用下发生链置换反应，启动DNA合成，被置换下来的DNA链与单链结合蛋白(Gp32)结合，防止进一步替换，通过此过程的循环实现目的片段的指数式扩增。RPA可以在相对较低的温度下，在30分钟内扩增目的DNA，非常适合快速现场检测。近年来RPA已应用于转基因作物、病毒、细菌等检测，但在食品中黄曲霉菌的检测方面还未见报道。

DNA的提取作为分子生物学检测的基础，直接影响着检测的可行性和灵敏度。因霉菌具有较厚的细胞壁，其DNA不易提取，目前常用的DNA提取方法主要是试剂盒法和CTAB法，但这些方法均存在操作繁琐、耗时，且对黄曲霉菌孢子DNA提取效果较差等问题。导致了目前已有的分子生物学检测方法普遍存在着灵敏度不高的问题。且目前的研究多集中在DNA的扩增阶段，对DNA的快速高效提取的方法研究较少。

因此，设计一种黄曲霉菌的RPA引物和试剂盒，并建立一种以RPA技术为基础的能够现场快速检测黄曲霉菌的方法与装置，成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置，解决了现有食品中黄曲霉菌生物学检测方法操作繁琐、耗时长、灵敏度不高且无法现场化操作的问题。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黄曲霉菌的RPA引物，包括：

正向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：