[发明专利]体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法

说明书

本发明提供了体外培育熊胆粉中异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，包括如下步骤：称取体外培育熊胆粉样品按照50‑200mg/5ml的比例置于水中，然后振荡8‑15分钟至样品完全溶解；将上述处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，冲洗，洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；将上述供试品溶液注入液相色谱‑质谱仪进行检测。本发明提供的测定方法通过对净化、检测步骤中的条件以及参数进行了调整和优化，具有中间精密度良好、准确度高、重复性良好的优点，此外，以稀释10倍的浓度作为该方法检出限，方法检出限为0.68mg/kg，因此为体外培育熊胆粉中IPTG残留量的检测提供了可靠易操作的方法，促进了对体外培育熊胆粉的安全性把控。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法。

背景技术

熊胆，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，具有清热、平肝、明目的功效。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历史，有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨，仍然满足不了人类健康的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加，使得熊胆粉的价格节节攀升，市场价格已经超过了5000元/kg。更为严峻的是，国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制，给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。因此，加快人工熊胆的研发是促进熊胆产业可持续发展的关键。申请号为201410588581.5的现有专利公开了一种人工熊胆粉及其制备方法，具体生产了一种体外培育(生物转化)熊胆粉，其以禽类胆粉为原料，通过体外模拟胆汁酸肝肠循环，采用两步酶促法与双酶联用循环转化技术对禽胆粉进行生物转化获得，其原料来源广泛易得，不需要再添加其他化学物质，可以促进熊胆产业健康发展。

但上述体外培育熊胆粉制备过程所需的关键酶菌体--A酶菌体和B酶菌体是通过7α-HSDH和7β-HSDH两个重组质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，经抗性筛选并通过多级培养后获得的。IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)是A酶菌体/B酶菌体诱导外源基因表达的诱导剂。为加强对体外培育(生物转化)熊胆粉的安全性把控，需对发酵过程中的主要添加物，特别是IPTG进行含量限度检查，但目前未有检测体外培育熊胆粉中IPTG残留量的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，包括如下步骤：

步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品按照50-200mg/5ml的比例置于水中，然后振荡8-15分钟至样品完全溶解；

步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，冲洗，洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

步骤三，将上述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测。

进一步地，上述固相萃取柱为亲水亲脂平衡固相萃取柱或强阴离子交换反相吸附填料固相萃取柱。

进一步优选地，上述固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取柱，其规格为500mg/6cc。

进一步地，步骤二中依次采用甲醇和水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化；甲醇和水的体积比为1:1。

进一步地，步骤二中采用水进行冲洗，采用甲醇溶液进行洗脱。

进一步优选地，步骤二中采用20％的甲醇溶液进行洗脱两次。

进一步地，步骤三中检测采用Waters CORTECS T3色谱柱，其规格为100mm×2.1mm，2.7μm。