[发明专利]一种鉴定茎用芥菜oxa细胞质雄性不育恢复基因的分子标记及其应用

说明书

本发明公开了一种鉴定茎用芥菜oxa细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，属于蔬菜分子育种技术领域。本发明通过对控制茎用芥菜oxa CMS恢复系中的基因片段进行PCR扩增，并与茎用芥菜细胞质雄性不育系中的基因序列进行比对，分别在基因序列保守和在恢复系中特异插入的一段核苷酸序列设计引物，设计开发了一对区分oxa CMS恢复基因有无的分子标记，在芥菜杂交育种中可以高效选育优良、稳定的oxa CMS恢复系。同时开发了另外一对鉴定oxa CMS恢复基因的基因型的分子标记，可以用于芥菜制种系统中杂交种的纯度鉴定，缩短育种年限，提高育种效率。

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，具体涉及到一种鉴定茎用芥菜oxa细胞质雄性不育恢复基因相关的分子标记。

背景技术

细胞质雄性不育(CMS)是由于线粒体基因组的突变、重排或者重组产生异常开放阅读框(ORFs),导致的雄蕊发育异常，而雌蕊却正常发育的一种生物学现象。它主要表现为母性遗传，能被显性核恢复基因恢复育性。细胞质雄性不育是植物杂种优势利用的主要途径之一，同时也是研究细胞质遗传以及线粒体和细胞核互作的良好媒介。

细胞质雄性不育植株是由于不能产生正常的功能性花粉而表现为雄蕊败育，然而恢复系的显性核恢复基因Rf却能够消除不育系中不育基因的作用，从而达到恢复育性的目的。Rf基因作为恢复植物育性和与CMS相关基因相互作用的重要遗传手段，在不同植物间被广泛报道。近年来，基于图位克隆的方法，已在许多植物中成功地鉴定出细胞核中的线粒体特异性Rf基因，主要包括水稻WA-CMS的恢复基因Rf4(Tang et al.2014)；高粱A1-WA的恢复基因Rf1和Rf2(Jordan et al.2010)；油菜Polima CMS的恢复基因Rfp(Liu et al.2016)。还有植物中第一个分离到的恢复基因——玉米中的Rf2，编码一个乙醛脱氢酶，恢复玉米T型不育胞质的育性(Cui et al.1996)。新Rf基因的克隆和鉴定将为CMS植株育性恢复的分子机制提供新的认识。

本课题组研究人员从2010年开始研究芥菜细胞质雄性不育源“oxa”的不育性特点及杂种优势的利用。通过连续多年的杂交、回交和测交，创制了茎用芥菜oxa胞质不育系、保持系和恢复系。通过多年多点研究发现：该不育系的柱头明显外露，蜜腺发达，不育度和不育株率均为100％，且该不育系杂种优势强，配合力高。同时细胞学观察和线粒体不育基因的分子标记鉴定发现：oxa CMS与已报道的十字花科不育类型均不相同，是一种新的细胞质雄性不育类型。因此进一步挖掘和克隆oxa CMS相关的不育基因和恢复基因，揭示CMS/Rf的生物学功能和作用机理，就显得尤为重要。本发明致力于开发一种精确区分oxa CMS恢复基因有无的分子标记，将其应用于快速准确鉴定利用oxa系统进行制种的杂交种纯度。

发明内容

本发明的目的是提供一种茎用芥菜oxa细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，该分子标记特异性强，重复性好，可以高效鉴定芥菜株系中是否有恢复基因的存在，从而在苗期鉴定植株是否具有对oxa CMS的恢复功能，以加快茎用芥菜杂交种纯度鉴定和新品种的选育，为中国特色蔬菜-茎用芥菜的产量性状育种提供理论依据和材料来源。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种区分茎用芥菜oxa CMS恢复基因有无的分子标记，包含一对SCAR标记，即BjGDI-F/R的引物组合，还有一种快速鉴定区分纯合杂合茎用芥菜的分子标记，也包含一对SCAR标记：即CRY3-F/R的引物组合。其中BjGDI-F的引物序列为：GACAAGGCTCCTGCTCATTTAGG；BjGDI-R的引物序列为：CAATTACTTGGTCACATCGGTATGG；CRY3-F的引物序列为：GGTTCTAGCAGAGACTACAATGTTG；CRY3-R的引物序列为：GTCACATCGGTATGGATAAGGAC。

利用上述的分子标记区分茎用芥菜oxa CMS恢复基因的方法，包括以下步骤：

(1)提取茎用芥菜的叶片DNA；