[发明专利]非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照、外源基因标准液、阴性提取对照液；所述荧光PCR反应液包含2×TaqMan® Fast AdvancedMaster Mix及VP72基因、外源基因、内源基因的上、下游引物和探针，其中，VP72基因为非洲猪瘟病毒结构蛋白VP72基因片段，外源基因为人工合成的特异性基因片段（WY基因）、内源为猪肌动蛋白β-actin基因片段（Pactin基因），上述三对特异性引物序列为：

VP72-F：5’-GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

VP72-R：5’-AATGTTTTTAATAATAGGTAATGTG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

WY-F：5’-CGGGTGATTCGCAAGATCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

WY-R：5’-CCAGTGTAGAGAAGGAAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；

Pactin-F：5’-TTGTCATGGACTCTGGGGATGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

Pactin-R：5’-AGTCCTGCGGCATCCACGAGACCA-3’，如SEQ ID NO.6所示；

特异性探针序列为：

VP72-P：5’-FAM-TTGATGGAAACTTATCGATAAGATTG-TAMRA-3’，如SEQ ID NO.7所示；

WY-P：5’-VIC-GCAGGTCTGTCCGTTCAACAGGGGAT-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.8所示；

Pactin-P：5’-ROX-TCACCGCTTCCGGTGTCCAGAGGC-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.9所示，其中，VP72基因探针、WY基因探针、Pactin基因探针中的FAM、VIC、ROX为荧光报告基团，TAMRA、BHQ1、BHQ2为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述非洲猪瘟病毒结构蛋白VP72基因片段的核苷酸序列为：

TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAACCGTTCTGAAGAAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGTAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAACTAATATAAAATTCTCTTGCTCTGGATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCACCCGGATCATCGGGGGTTTTAATTGCATTGCCTCCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTATCGATAAGATTGATACCATGAGCAGTTACGGAAATGTTTTTAATAATAGGTAATGTGATCGGATACGTAACGGGGCTAATATCCGATATAGATGAACATGCGTCTGGAAGAGCTGTATCTCTATCCTGAAAGCTTATCTCTGCGTGGTGAGTAGGCTGCATAATGGCGTTAACAACATGTCCGAACTTGTGCCAATCTCGGTGTTGATGAGGATTTTGATCGGAGATGTTC，如SEQ IDNO.10所示；

所述人工合成的特异性基因片段的核苷酸序列为：

ATAGTCCTAATCCCGGGTGATTCGCAAGATCTTGACAGCAGGTCTGTCCGTTCAACAGGGGATTGTTCGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTAGAGAAGGAAAATTGTAGACGAAGGGTCGAAAGCTCAAGGACAATTAGGCTGGTTGGAGAATAAAGATATTGACTTTTCTTGGAAAGTGGCGCAGTCAAGTATTTGGAAGGGCACGGGTTCCGTTTTGAAGTCAAGAATAGACATAGAAGTTGATGATGCTGAGCAATTCAATATCTTGCTAGCTTCCATCTTGGCTCAAATTTGGGCGTGATGGAGTGAAGCGCCTT，如SEQ ID NO.11所示；

所述猪肌动蛋白β-actin基因片段的核苷酸序列为：

AGACCTTCAACACGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCCGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGCCGCACCACTGGCATTGTCATGGACTCTGGGGATGGGGTCACCGCTTCCGGTGTCCAGAGGCGCTCTTCCAGCCCTCCTTCTTGGGCATGGAGTCCTGCGGCATCCACGAGACCACCTTCAACTCGATCATGAAGTGCGACGTGGACATCAGGAAGGACCTCTACGCCAACACGGTGCTGTCTGGCGGGAC，如SEQ ID NO.12所示。