[发明专利]非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其制备方法与应用。该检测试剂盒包括荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照、外源基因标准液、阴性提取对照液。所述荧光PCR反应液包含VP72基因、外源基因、内源基因的上、下游引物和探针。本发明通过设置内源基因作为整个检测过程中的内部质控，监测样本采集、提取和扩增的全过程；设置外源基因作为核酸提取过程中的外部阳性质控，将外源基因添加于样本核酸提取过程中伴随着样本一起进行核酸提取，根据外源基因PCR反应Ct值的变化来监测核酸提取试剂盒的核酸提取效果，增大了检测结果的准确性，减少了假阴性结果。

技术领域

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，涉及一种非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害甚大，为世界动物卫生组织（OIE）规定须通报动物疫病，也是我国重点防控的一类动物疫病。2018年我国在辽宁省首次报告发现ASF疫情，随后其扩散蔓延到全国其他地区，给我国养猪业带来了极大经济损失。由于ASF的临床症状和病理变化很难与猪瘟等其他疫病区分，并且目前没有有效疫苗可用，因此快速准确的实验室诊断具有重要意义。经典的血吸附试验、病毒分离鉴定等检测诊断方法，对生物安全设施条件要求较高，在试验特异性以及检测时间等方面也有所限制。相比之下，荧光PCR具有较高的敏感性和特异性，可同时快速检测高通量样品，被广泛应用于ASF诊断和检测。

目前，主要有三个因素影响荧光PCR的实验结果，即标本因素（样本的采集部位、样品的质量以及样本的保存方法、保存时间等）、人员因素（实验人员的工作态度、技术水平以及在实际操作过程中的操作习惯等）、仪器因素（仪器设备的稳定性、均匀度、光敏感感应管、加热退火的模块和时间、激发灯管的强度、数据分析的难易程度）。针对以上技术问题，本发明通过设计ASFV VP72基因、外源基因、内源基因三重特异性引物与探针，监测样本采集、提取和扩增的全过程，解决荧光PCR检测过程中因采样不规范、核酸提取操作失误造成的假阴性、假阳性现象，提高检测结果的准确性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒三重荧光PCR检测试剂盒，包括荧光PCR反应液、阳性对照、阴性对照、外源基因标准液、阴性提取对照液；所述荧光PCR反应液包含2×TaqMan® Fast Advanced Master Mix及VP72基因、外源基因、内源基因的上、下游引物和探针。其中，VP72基因为非洲猪瘟病毒结构蛋白VP72基因片段，外源基因为人工合成的特异性基因片段（WY基因）、内源为猪肌动蛋白β-actin基因片段（Pactin基因）。

上述三对特异性引物序列为：

VP72-F：5’-GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

VP72-R：5’-AATGTTTTTAATAATAGGTAATGTG-3’， 如SEQ ID NO.2所示；

WY-F：5’-CGGGTGATTCGCAAGATCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

WY-R：5’-CCAGTGTAGAGAAGGAAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；

Pactin-F：5’-TTGTCATGGACTCTGGGGATGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

Pactin-R：5’-AGTCCTGCGGCATCCACGAGACCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。

特异性探针序列为：