[发明专利]用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法

说明书

本发明公开了一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法，该传感器包括带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子，该带有荧光的Fe@QD@Apt和DNA修饰的金纳米粒子通过互补配对DNA与Apt组装在一起。本发明基于荧光能量共振转移技术，检测方法具有方便快捷、价格低廉、超低检测限的特点，为液体活检应用提供重要思路。

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，尤其涉及一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法。

背景技术

作为一种活细胞释放的细胞外囊泡，外泌体从其母细胞继承了大量生物物质，并积极参与细胞间，细胞间环境的通讯，并在生理和病理过程中发挥重要作用。由于其独特的起源，丰富的生物学信息以及分离后的良好稳定性，外泌体已成为具有广泛应用前景的生物标志物。外泌体上特异性或过表达的蛋白质描述与疾病的发生和发展密切相关。例如，黑色素瘤细胞衍生的外泌体表达高水平的PD-L1蛋白，从而干扰免疫细胞的活性以抑制免疫系统。这种影响与过度表达的上皮恶性肿瘤标志物EpCAM对上皮恶性肿瘤(典型的是结肠癌，食道癌，胃癌，肝细胞癌和肺癌)相似。在此基础上，系统地鉴定外泌体并解决外泌体上相应特征蛋白(例如EpCAM)的差异水平，可以解决当前对有效和准确预测癌症以及实时监测疗效和预防转移的挑战。

要分析外泌体，对其的高效分离应该是第一步。尽管有各种方法(例如蛋白质印迹，酶联免疫吸附测定，聚合酶链反应)，仪器(质谱，流式细胞仪，拉曼光谱)和其它生物学方法检测外泌体，其局限性是显而易见的。比如，需要大量样品，昂贵且专用的仪器，专业的操作人员，繁琐的操作步骤，昂贵的试剂的要求，无疑会阻碍其在及时、经济的体外诊断中的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器及制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于外泌体检测的荧光共振能量转移磁传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1.向含5-15mg/mL的表面带羧基的超顺磁Fe3O4纳米粒子的PBS缓冲液中加入0.5-1.5mg PEI，振荡1-2h后磁分离，得到Fe@PEI；再加入含有0.2-1μL羧基量子点的硼酸盐缓冲液，得到Fe@QD；

S2.向50-70μM PAA溶液中加入100-150μM EDC和220-250μM NHS，活化1-2h后，加入5-15μM适配体，37℃振荡10-15h，得到PAA-Apt；

S3.向S1中所得Fe@QD加入PEI溶液再修饰一层PEI，磁分离后加入S2所得PAA-Apt，振荡30-50min后磁分离弃去上清液，于PBS缓冲液中重悬，得到Fe@QD@Apt；

S4.向含15-25μM巯基-DNA的醋酸盐缓冲液加入5-15mM TCEP，25℃孵育1-2h，再加入10-15nm的金纳米粒子，室温反应13-18h，逐滴加入醋酸盐缓冲液，然后加入1-2M NaCl溶液，得到Au-DNA；

S5.向S3所得Fe@QD@Apt悬浮液中加入PBS缓冲液，然后滴加S4所得Au-DNA，在37℃下孵育4-5h，用PBS缓冲液清洗，即得。

本发明的传感器基于荧光能量共振转移(FRET)技术，分为两个部分，第一部分是带有荧光的Fe@QD@Apt，其中，外围的Apt为可特异性识别某种特定抗原的适配体。第二部分是DNA修饰的金纳米粒子，这一段DNA可与第一部分的Apt部分互补配对，因此这两个部分可以通过互补配对组装在一起，与此同时第一部分的荧光发射峰处在金纳米粒子的吸收峰内，两者发生荧光能量共振转移(FRET)，因此组装体的荧光强度大幅降低，在检测到外泌体后，外泌体会特异性结合适配体Apt，从而撕裂与Au的结合，FRET被打断，从而荧光强度上升，实现荧光的“点亮”，从而来达到检测外泌体的目的。