[发明专利]一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的方法

说明书

本发明提供一种提高间充质干细胞(MSC)分化为神经前体细胞产量的方法，通过改变细胞培养基质表面环境，使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质，对间充质干细胞进行培养。所述方法可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种提高间充质干细胞(MSC)分化为神经前体细胞产量的方法。

背景技术

中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。

神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPCs)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPCs缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPCs能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但NPC来源极为有限，限制了其临床应用。成体NPCs的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPCs又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPCs研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin+神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。

目前应用于间充质干细胞分化为神经前体细胞的方法主要有：(1)化学诱导剂法：添加化学诱导剂如β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基茴香醚、维甲酸等；(2)细胞生长因子法：添加生长因子如NGF、EGF、bFGF、低浓度TNF-α等；(3)化学诱导剂与生长因子联合的方法；(4)其他：添加创伤性脑组织匀浆，脑组织上清液，脱细胞神经移植物，与神经细胞、神经干细胞或视网膜色素上皮细胞共培养或用接近生理状态的条件培养基，基因转染，传统中药(如黄芩苷、红景天苷、川芎嗪、丹参、天麻、人参)等。理想的移植细胞应具有创伤小，易于获得，易于体外扩增，不涉及免疫排斥致瘤性及伦理学问题等。而常用的化学诱导剂虽可以快速诱导生成神经样细胞，但存在细胞纯度低、质量参差不齐，并且活力差，平均4天出现死亡或凋亡等问题。细胞生长因子诱导法存在诱导效率低下，诱导周期长，且存活时间短等缺陷，甚至有些文献认为神经因子诱导法生成的神经样细胞，仅仅形态上像神经细胞，而不具备神经细胞的功能；化学诱导剂与生长因子联合的方法仍不能避免上述缺陷。与各种细胞和脑组织液共培养的方法存在细胞采集复杂或异体异种蛋白产生免疫排斥及传播疾病的缺点。

综上，上述方法均存在一些缺点，包括效率低、耗时长、系统重复性较差或者细胞诱导后活性不良、所得细胞不纯等，最终不能获得功能细胞。因此，本领域还有必要开发改进的技术，来提高分化效率、提高神经前体细胞的产量。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种通过改变细胞培养基质表面环境，使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养基质，对间充质干细胞进行培养的方法，所述方法可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

本发明提供一种提高间充质干细胞分化为神经前体细胞产量的方法，包括如下步骤：

(1)分离间充质干细胞，原代培养；

(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；

(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；