[发明专利]一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用

权利要求书

1.一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、HEK 293T细胞准备：选择来源明确且生长状态良好的细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂处理两代，保证细胞状态；

S2、转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染细胞，转染6～8h之后更换培养基，根据需要构建的细胞系选择合适的培养基换液；

S3、病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，得到纯化后的浓缩慢病毒液；

S4、将需要构建的细胞系的细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin浓度梯度加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度；

S5、慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系的细胞，待生长状态良好时，接种细胞在培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL聚凝胺的培养基，并加入浓缩病毒液，感染之后换为新鲜正常的培养基；

S6、药物筛选：感染培养一段时间后加入含有步骤S4中选定筛选药物浓度培养基进行筛选，至不会有死细胞出现；

S7、挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行鉴定。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，所述支原体抑制剂处理为采用Biomyc-3；

在步骤S2中，所述阳离子介导的细胞转染方法采用如下步骤：

①转染前接种适宜密度的细胞；

②细胞密度达到70％～90％时进行转染，转染前1h将更换培养基；

③吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入5μg待转染质粒；

④再次吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入2μL VigoFect转染试剂，混匀后室温静置5min；

⑤将第④步稀释的VigoFect逐滴加入到第③步中的质粒中，室温放置15min；

⑥将静置后的混合液均匀滴加到细胞培养基中并混匀；

⑦转染6～8h后更换培养液。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，所述低密度接种为细胞接种贴壁后密度达到30％～40％；所述Blasticidin浓度梯度为设置的浓度梯度为0、2、4、6、8、10μg/mL；

在步骤S5中，所述感染的时间为6～8h之后换为新鲜正常的培养基。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S6中，所述感染培养段时间是指培养32～48h，在筛选过程中细胞密度过高时要进行传代处理，保证筛选过程中细胞密度不超过80％；

在步骤S7中，在10cm培养皿中接种3000～5000个细胞。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤S8中，所述鉴定为westernblotting检测表达的SpCas9蛋白或采用检测SpCas9序列的引物采用PCR检测细胞基因组。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述检测SpCas9序列的引物包括正向引物ATGGACAAGAAGTACAGCATCGG和反向引物GTCGCCTCCCAGCTGAGAC。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增条件为94℃预变性10min；94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸1kb/min，25～30个循环；72℃延伸10min进行检测。

8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，需要构建的细胞系为小鼠成肌细胞C2C12细胞或小鼠胚胎干细胞E14细胞。