[发明专利]一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用

说明书

本发明涉及一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法及其应用，构建方法包括：慢病毒的包装以及纯化，包括HEK 293T细胞准备，转染包装质粒，转染培养后收取细胞培养上清，浓缩病毒液；将得到的浓缩病毒感染细胞，包括药物浓度筛选，慢病毒感染细胞，药物筛选，挑取单克隆进行鉴定。采用稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，获得小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系和小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系，可稳定表达SpCas9蛋白，可作为快速验证工具，用于对设计的SgRNA进行快速的功能验证来检测SgRNA设计是否成功，同时也可以作为功能基因的筛选体系进行后续的大规模功能基因筛选。

技术领域

本发明涉及一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法及应用，属于细胞生物技术领域。

背景技术

现有的SgRNA验证以及功能基因筛选技术体系中，大都采用单质粒系统表达SpCas9蛋白，一般单质粒系统为真核表达系统，导致在某些原代细胞或者某些低转染效率的细胞系中无法进行有效的SgRNA功能验证以及功能基因筛选。如何能有效表达SpCas9蛋白是亟需要解决的技术问题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系构建的方法，并提供小鼠成肌细胞C2C12稳转表达SpCas9蛋白细胞系和小鼠胚胎干细胞E14稳转表达SpCas9蛋白细胞系。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种稳转表达SpCas9蛋白细胞系的构建方法，其包括如下步骤：

S1、HEK 293T细胞准备：选择来源明确且生长状态良好的HEK 293T细胞，将复苏的细胞用支原体抑制剂处理两代，保证细胞状态；

S2、转染包装质粒：按照阳离子介导的细胞转染方法进行转染，病毒包装质粒的比例为LentiCas9：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1的质量比例转染HEK 293T细胞，转染6～8h之后更换培养基，根据需要构建的细胞系选择合适的培养基换液；

S3、病毒收取：转染36～48h之后可以收取细胞培养上清，用0.45μm滤器过滤去掉细胞碎片，并用Millipore柱子浓缩病毒液，得到纯化后的浓缩慢病毒液；

S4、将需要构建的细胞系的细胞以低密度接种在六孔板种，待贴壁生长之后，设置筛选标记药物Blasticidin浓度梯度加入到六孔板种，加入24h后观察细胞生存状况，选择细胞接近90％死亡时的浓度；

S5、慢病毒感染细胞：复苏需要构建细胞系的细胞，待生长状态良好时，接种细胞在培养皿中，细胞贴壁之后，更换为含有终浓度为8μg/mL聚凝胺(polybrene)的培养基，并加入浓缩病毒液，感染之后换为新鲜正常的培养基；

S6、药物筛选：感染培养一段时间后加入含有步骤S4中选定筛选药物浓度培养基进行筛选，至不会有死细胞出现；

S7、挑取单克隆：经过药物筛选的细胞消化后细胞计数，培养一周后出现肉眼可见的细胞克隆，随后挑取单克隆至96孔板中，扩大培养，后收取细胞样品进行鉴定。

如上所述的构建方法，优选地，在步骤S1中，所述支原体抑制剂处理为Biomyc-3。

如上所述的构建方法，优选地，在步骤S2中，所述阳离子介导的细胞转染方法采用如下步骤：

①转染前接种适宜密度的细胞；

②细胞密度达到70％～90％时进行转染，转染前1h将更换培养基；

③吸取100μL 0.9％的灭菌生理盐水于1.5mL EP管中，加入5μg待转染质粒；