[发明专利]一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为在SEQ ID No.7所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3和Cy5中的任意一种。

4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中的任意一种。

5.一种试剂盒，包括权利要求1～4任意一项所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：所述引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的独立浓度为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；24管RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉；反应缓冲液1000～1800μL；阴性质控品25～35μL；浓度为1.0×10⁵copies/μL的阳性质控品。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为ddH₂O。

8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有环孢子虫DNA片段的质粒，所述环孢子虫DNA片段的序列如SEQ ID No.10所示。

9.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA基础荧光通用反应试剂组份包含重组酶，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，dNTPs。

10.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。

11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，实时荧光RAA反应体系每50μL包括：RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉，47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品、阴性质控品、阳性质控品；

所述实时荧光RAA反应的条件包括：所述实时荧光RAA反应的温度为25～42℃，所述实时荧光RAA反应的时间为15～25min。

12.如权利要求1～4任意一项所述的引物探针组合物在制备环孢子虫检测产品中的应用。