[发明专利]一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物和试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于实时荧光RAA法检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的探针。此外，本发明还公开了包含了上述引物探针组合物的试剂盒及该引物探针组合物的应用。本发明能够快速、有效地检测环孢子虫，检测准确性、特异性和敏感性高，所述的检测试剂盒灵敏、稳定、有效。

技术领域

本发明涉及寄生虫的分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种用于定性检测环孢子虫DNA的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

环孢子虫(Cyclospora，又称圆孢子虫)是一种人畜共患的肠道致病性原虫，在免疫功能正常或免疫受损的个体中均可导致严重腹泻及其他胃肠道疾病，同时还伴随有食欲减退、乏力、腹胀、腹痛、恶心、呕吐、体质量减轻等症状，严重的甚至导致死亡。环孢子虫生活史属于典型的单宿主型，即在一个宿主体内完成无性繁殖和有性繁殖。宿主刚排出粪便中的环孢子虫卵囊无感染性，卵囊需在适宜的温度下(22～32℃)经过1～2周左右的孢子化过程才具有感染性。

19世纪90年代以前仅有散在的环孢子虫病的流行，以后，环孢子虫感染在全球范围内大规模暴发。环孢子虫病最初主要发生于尼泊尔、印度尼西亚、危地马拉、约旦等国家，因此被认为是发展中国家的地方性疾病。后来，环孢子虫病在美国、加拿大、德国、墨西哥和土耳其等国家相继暴发，其暴发流行通常与前往发展中国家的旅行者或食用进口新鲜食品有关。在我国河南、云南、陕西、安徽、广东和浙江等省份也报道了多起环孢子虫感染病例。

目前，环孢子虫常用的检测方法主要为直接涂片法、染色显微镜检查、流式细胞仪检测与及核酸检测。因其卵囊微小，故直接涂片法与显微镜检查存在一定的漏检和误诊；流式细胞仪的设备复杂、成本较高，不适宜大规模推广应用。以上方法对环孢子虫的检测均有一定的局限性，限制了环孢子虫暴发流行的及时检测和溯源。分子生物学方法因其高灵敏度、快速、廉价的特点被国内外研究人员所青睐，也成为环孢子虫检测研究的一个热点和趋势。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供环孢子虫实时荧光RAA检测试剂盒，使其能够快速、有效地对环孢子虫进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于实时荧光RAA检测环孢子虫DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针的序列如SEQ ID No.7所示。

优选的，所述探针为在SEQ ID No.7所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第35位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。

优选的，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3和Cy5中任意一种。

优选的，所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3和DABCYL中任意一种。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品。

优选的，所述试剂盒中包括：引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的独立浓度为0.03～0.07mM，所述探针的浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂150～250μL；反应缓冲液1000～1800μL；阴性质控品25～35μL,成份为ddH₂O；浓度为1.0×10⁵copies/μL的阳性质控品。