[发明专利]一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明通过对嗜热厌氧菌Dictyoglomusthermophilum来源的纤维二糖差向异构酶进行定向进化，得到突变体能仍然具备将乳糖转化为乳果糖的性能，且酶活和底物转化率显著提升，在相同加酶量的条件下，乳果糖转化率最高可达58.2％，较野生型提高了35.35％，具有良好的工业应用性能。

技术领域

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶的突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

乳果糖(4-O-β-D-galactopyranosyl-D-fructose，Lactulose)又名异构乳糖、乳酮糖或半乳醣果糖，是半乳糖和果糖通过β-1,4-糖苷键结合而成。乳果糖分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，与乳糖是同分异构体。乳果糖成品为淡黄色澄明粘稠体，微甜，其结晶体为白色不规则粉末，密度为1.32g/cm³，在水中溶解度76.4％(30℃)，折射率为1.45-1.47。乳果糖甜度相当于乳糖，是蔗糖的48％-60％，口感清凉，粘度较低，热值低，较安全，较稳定，不易发生美拉德反应。

乳果糖由于其特殊的生理功效，被广泛的应用于药品、食品工业以及饲料工业中。主要包括以下几个方面：

(Ⅰ)乳果糖在医学中的应用。自1960年开始，乳果糖就已被批准作为治疗便秘的药物，且各年龄段人群均可使用。乳果糖类药物还会刺激肠炎病人小肠内低分子量有机酸的合成，降低环境pH，促进有益菌种乳酸菌等生长，抑制感染类细菌的滋生，为治疗肠道感染提供了一种新型的治疗方式。乳果糖通过酸化结肠环境，将自由扩散的氨(NH₃)转化为铵离子(NH₄⁺)，使其不能扩散回血液，从而降低血氨值，降低肝性脑病的患病率。同时，乳果糖还可以增加人体对食物中矿物质的吸收。

(Ⅱ)乳果糖在食品中的应用。根据国标GB2760-86的规定，乳果糖可以添加到鲜乳、乳粉、奶油粉、饼干、婴幼儿配方食品以及饮料类产品中。乳果糖不会被人体肠道消化吸收，可用作糖尿病患者的甜味剂，也可以替代婴儿奶粉、烘焙产品、酸奶、乳制品种的传统糖分。有研究表明，在婴幼儿奶粉中添加2％乳果糖即可达到母乳喂养的效果。乳果糖还具有良好的保湿性，可防止糕点由于表面风干硬化影响其口感。还可以作为风味增强剂，在巧克力的生产中产生有利的褐变行为。

(Ⅲ)乳果糖在饲料中的应用。2011年，乳果糖被欧盟饲料和食品质量安全管理局(Quality and Safety of Feeds and Food for Europe；European Commission 2011)认定为一种新型饲料添加剂。它可以通过促进双歧杆菌和乳酸杆菌增殖，抑制沙门氏菌的生长，提高畜禽对肠道疾病的免疫力，从而减少抗生素在饲料中的使用。研究证明，向肉鸡食用的饲料中添加适量的乳果糖，肉鸡净增量、存活率都有一定的增加。

目前，商业化的乳果糖主要是由化学法合成。这一过程需要大量的化学催化剂，并产生大量副产物，涉及复杂的分离和纯化步骤。相对而言，酶法催化乳糖生成乳果糖条件比较温和，可以克服化学法生产乳果糖的一些缺点，适合低碳经济和绿色环保的要求。

目前用于催化乳糖生成乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase,EC3.2.1)和纤维二糖差向异构酶(Cellobiose 2-Epimerase,CE,EC5.1.3.11)。而在这其中，纤维二糖差向异构酶(CEs)能够直接催化单一乳糖生产乳果糖，是目前最高效的乳果糖制备用酶，因而受到了广泛的关注。但是目前的纤维二糖异构酶酶活较低、乳果糖转化率不高，阻碍了纤维二糖异构酶的工业化生产。

发明内容