[发明专利]高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用

说明书

本发明公开了一种高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用，该重组酵母菌株是以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为底盘细胞，通过敲除靶基因PDC1和ADH1，得到一突变型酵母菌株，实现了乙醇合成途径的弱化。在此基础上，异源表达来自梭菌的7α‑HSDH和7β‑HSDH编码基因，旨在实现将CDCA为底物生物合成UDCA。目前，底物CDCA的转化率达到90％。

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种高效转化鹅去氧胆酸的重组酵母底盘细胞改造及重组菌株构建与应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。

熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid,UDCA)是传统的中药的有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，在治疗胆结石、促进肝移植、胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化和药物诱发的肝炎，有非常好的疗效，市场用量很大。目前，制备UDCA主要有活熊取胆汁和人工合成两种方法，天然来源是活熊取胆或熊胆汁，活熊受到动物保护法的保护，提取来源受到限制造成天然熊胆的来源日趋减少。人工合成是指使用能够大量获取的牛、鹅胆汁提取的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)化学法合成UDCA，通过氧化还原的方法使7-OH发生构型反转，但是存在着反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题，尤其是保护和脱保护过程中需要有毒和危险试剂，严重限制了化学法的工业化应用。目前使用化学法生产的UDCA约占到市场份额的30％，而且制备高纯度较低，约80％左右，还远不能满足市场对UDCA的用量及质量的需求。

与化学差向异构化相比，CDCA生物合成UDCA具有高效性和相对环境友好性。微生物转化或生物酶催化主要围绕7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)展开，利用产7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和谐梭菌、巴氏梭菌和嗜麦芽黄单胞菌，实现了CDCA向UDCA的生物转化，UDCA的生物酶催化反应过程如图1所示。

然而，高浓度的CDCA抑制细胞生物量的积累，在产品回收和纯化过程中存在困难。此外，以往的研究表明，随着培养时间的延长，中间体的产量增加，UDCA降低，无法实现工业化生产。

Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(Appl Environ Microbiol,1982,43(5):1057-1063)，但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135)，发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680)，重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。

综上，目前仅有报道有关7α-HSDH和7β-HSDH在大肠杆菌中的表达，而该酶在其他菌株中能否实现同样的表达，尚不明确，需要科研工作者的进一步探索研究。

发明内容