[发明专利]一种高通用性的核酸检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种由分子连接单元和信号放大生成单元组成的核酸检测方法。其中分子连接单元是两条脱氧核糖核酸(DNA)探针，按功能分为识别端和触发端，当识别端与目标核酸互补配对结合后，使触发端靠近并诱发信号放大生成单元发生放大反应，实现核酸的检测。对不同目标核酸的检测，只需更换与目标核酸互补的识别端序列，其它DNA探针序列保持不变，极大地提高了探针的通用性。有利于DNA探针的规模化生产，降低使用成本。本发明还提供了一种高通用性的核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种高通用性的核酸检测方法及试剂盒。

背景技术

核酸检测在病原微生物鉴别和食品安全检测等方面具有重要的应用价值。由于样品中极低的核酸浓度，对其直接检测存在一定难度。随着生物技术和分析技术的发展，高灵敏、高选择的信号放大技术有效地实现了超低浓度的核酸检测。其中，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）利用模板链、杂交引物等，在聚合酶作用下通过控制温度循环来实现核酸扩增，是目前应用最为广泛的核酸检测技术。开发不需要精确控制温度循环、样品前处理简单、耗时短的检测技术仍是迫切需求。新的放大技术如滚环放大（Rolling Circle Amplification，RCA）、环介导等温扩增（Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP）、杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）和催化发夹组装（Catalyzed Hairpin Assembly，CHA）等信号放大技术不断发展。这些检测技术需要根据目标核酸的序列定制DNA探针，存在设计难度大、合成周期长、使用成本高等问题。这些不足严重限制了它们的大规模应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的核酸检测方法中脱氧核糖核酸（DNA）探针通用性不足，为解决上述技术问题，提供了能够提高通用性的核酸检测方法。该方法包括分子连接单元、信号放大生成单元两部分。其中分子连接单元可分为识别端和触发端，在缓冲溶液中，当识别端与目标核酸结合后，两个分散的触发端靠近并诱发信号放大生成单元发生放大反应（催化发夹组装，CHA），释放出的富G序列在氯化血红素（hemin）和K⁺的存在下，形成G-四链体DNA酶。该G-四链体DNA酶能催化H₂O₂介导的生色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）产生蓝色产物，经H₂SO₄终止可形成稳定的黄色溶液。紫外分光光度计下测定450 nm处的吸光度。

上述的缓冲溶液，所用的Tris-HCl缓冲液浓度为20 mM（20 mM Tris三羟甲基氨基甲烷，100 mM NaCl，20 mM KCl，20 mM MgCl₂，1 M HCl调节溶液pH值7.4）；HEPES缓冲液浓度为25 mM HEPES（25 mM 4-（2-羟乙基）-1哌嗪乙磺酸，200 mM NaCl，20 mM KCl，0.05%Triton X-100，1% DMSO，pH=7.4）。

上述的分子连接单元是两条不互补的探针P1和P2，所述探针P1的序列为表一SEQID No.3所示的序列，所述探针P2的序列为表一SEQ ID No.5所示的序列；上述的信号放大生成单元包括发夹探针H1和H2，所述发夹探针H1的序列为表一SEQ ID No.1所示的序列，所述发夹探针H2的序列为表一SEQ ID No.2所示的序列。

上述的检测方法，优选的，所述探针P1和P2浓度均为25 nM。

上述的检测方法，优选的，所述发夹探针H1浓度为25、50、75、100、125 nM；进一步优选的所述发夹探针H1浓度为100 nM。

上述的检测方法，优选的，所述发夹探针H2浓度为25、50、75、100、125 nM；进一步优选的所述发夹探针H2浓度为75 nM。