[发明专利]一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，包括基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D‑薄荷酮、卡瓦内酯、IFN‑γ、EGF、柠檬酸锌。培养基中添加的二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白和卡瓦内酯协同作用调控诱导多能干细胞的有丝分裂周期，加快细胞代谢，缩短细胞分裂周期，使细胞保持较高的增殖速度。呋喃二烯、D‑薄荷酮有助于诱导多能干细胞保持增殖活性和较好的生长状态，为保证细胞增殖的稳定性发挥作用。IFN‑γ、EGF、柠檬酸锌为细胞的增殖提供营养供给，和基础培养基一起为细胞的增殖提供能量。本发明还提供了上述无血清培养基的制备方法，过程简便易于操作，为产品的商业化提供便利。

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基，尤其涉及一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)是用反转录病毒将多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc转染至体细胞，并使之重编程为能够无限增殖与分化的一类细胞，它与胚胎干细胞类似，体内外均能无限增殖，可分化为人体内几乎所有类型的细胞；同时，诱导多能干细胞具有取材简便、无免疫排斥反应、无道德伦理争议等优点，从而成为再生医学治疗研究中理想的种子细胞。

然而，目前限制人诱导多能干细胞进行临床转化和药物筛选等相关应用的一个关键的因素是缺乏稳定的、可大量扩增的培养基，因此，对于广泛的研究应用和病患需求，现有技术条件无法满足短时间内生产出足够数量的高质量的诱导多能干细胞。

诱导多能干细胞的最初采用的培养条件都需要明胶包被和饲养层细胞的支持。此外，传统培养基还采用成分复杂的血清替代品作为主要的培养基添加剂。由传统培养条件产生的诱导多能干细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，传统培养条件还很不稳定，不能满足实验和临床的应用需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种诱导多能干细胞的无血清培养基，成分明确，使用安全，可显著提高诱导多能干细胞的增殖效率。

本发明的目的之二在于提供一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于诱导多能干细胞的无血清培养基，包括基础培养基，添加在基础培养基中的以下成分：胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、IFN-γ、EGF、柠檬酸锌。

进一步地，以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素10-15μg/mL、二氯酚嗪1-4μg/mL、硫酸肝素糖蛋白15-20μg/mL、呋喃二烯1-5ng/mL、D-薄荷酮2-7ng/mL、卡瓦内酯10-15μg/mL、IFN-γ5-10ng/mL、EGF10-15ng/mL、柠檬酸锌12-17μg/mL。

进一步地，以终浓度计各组分的用量如下：胰岛素12μg/mL、二氯酚嗪3μg/mL、硫酸肝素糖蛋白18μg/mL、呋喃二烯3ng/mL、D-薄荷酮5ng/mL、卡瓦内酯12μg/mL、IFN-γ8ng/mL、EGF12ng/mL、柠檬酸锌15μg/mL。

进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述用于诱导多能干细胞的无血清培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)向基础培养基中加入胰岛素、二氯酚嗪、硫酸肝素糖蛋白、IFN-γ、EGF搅拌混合均匀；

(2)向步骤(1)的混合物中加入呋喃二烯、D-薄荷酮、卡瓦内酯、柠檬酸锌，继续搅拌至混合均匀后静置，过滤除菌后即得。