[发明专利]一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明中，L‑苏氨酸生产菌株TWF001通过改变细胞内的渗透压来改善大肠杆菌苏氨酸的合成途径。本发明在大肠杆菌TWF001中敲除负责编码渗透压保护剂甜菜碱转运的proP和proVWX基因，得到重组菌株TSW003，继续敲除磷酸转移酶(PTS)系统的crr或ptsG基因得到重组菌株TSW008或TSW009，最后TSW008摇瓶发酵36h后产生24.9g/LL‑苏氨酸，TSW009摇瓶发酵48h后产生26g/LL‑苏氨酸，比对照TWF001分别增加了108％和116％。

技术领域

本发明涉及一种敲除基因proP和proVWX高产苏氨酸的工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

发酵生产过程中，由于渗透压的不平衡，经常遇到生长受限和产物生物合成终止的问题。因此，提高细菌的耐渗透压能力或使用高渗抗性菌株成为生物产品发酵生产的新方向。已开发出高渗抗性菌株Halomonas bluephagenesis，可在高渗透压下产生L-苏氨酸，在摇瓶和7L发酵罐中L-苏氨酸产量分别达到7.5g/L和33g/L。渗透压保护剂已用于改善发酵过程中渗透压不平衡引起的生长和产量限制。但这些方法还不能满足工业生产的需求，因此对高产L-苏氨酸且高渗耐受性菌株的筛选和遗传修饰，具有十分重大的意义。

甜菜碱由于其特殊的甲基化相关结构而被用作渗透保护剂。在大肠杆菌中，甜菜碱在细胞生长和目标代谢产物的产生中起着不可或缺的作用。为了在发酵的后期维持细菌的活性，可以添加甜菜碱以提高对渗透压的耐受性。添加甜菜碱可以增加大肠杆菌中乳酸或苏氨酸的产量和谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的产量，对于L-苏氨酸产量也有一定的提高，然而甜菜碱浓度超过2g/L就会对苏氨酸生产有副作用。

大肠杆菌中的甜菜碱生物合成涉及以下基因：编码胆碱脱氢酶的基因betA，编码甜菜碱醛脱氢酶的基因betB，编码胆碱的基因betT，H(+)转运蛋白和调控基因betI。当细胞外渗透压升高时，渗透保护剂(如甜菜碱)会通过转运蛋白从培养基中吸收或通过细胞内生物合成在细胞中蓄积。大肠杆菌中主要的甜菜碱转运蛋白是主要转运蛋白(ProP)和次要转运蛋白(ProVWX)，它们受渗透压调节。在一个主要的渗透调节启动子的控制下，基因proP和proV，proW和proX均协同表达。

磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate：carbohydratephosphotransferase system，PTS)是大肠杆菌细胞内参与葡萄糖从膜间质转运和磷酸化到胞内的主要活性转运系统，影响苏氨酸合成前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的利用率。通过对PTS系统的定向修饰和改造，调节细胞内代谢流向，提高碳源利用率，增加苏氨酸前体合成量，能够构建出较为理想的苏氨酸高产菌。

发明内容

本发明通过敲除编码渗透压保护剂甜菜碱转运蛋白ProP和ProVWX来改变胞内渗透压，使L-苏氨酸产量得到提高；通过进一步敲除编码细菌磷酸转移酶(PTS)系统中的crr或ptsG基因，提高L-苏氨酸的产量。

本发明的第一个目的是提供一种影响细胞内渗透压平衡来提高苏氨酸产量的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上负责转运渗透压保护剂甜菜碱的基因，所述负责转运渗透压保护剂甜菜碱的基因为proP和proVWX。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌TWF001，大肠杆菌TWF001己公开于2018年的论文《Increasing L-threonine production in Escherichia coli byengineering the glyoxylate shunt and the 1-threonine biosynthesis pathway》中。

在一种实施方式中，所述基因proP来源于大肠杆菌，其敲除片段序列如SEQ IDNO.1。